Dactolisib(BEZ235)是一種具有口服活性的、雙重的pan-class I PI3K和mTOR抑制劑，作用于p110α/γ/δ/β和mTOR，IC50分別為4 nM/5 nM/7 nM/75 nM和20.7 nM。Dactolisib(BEZ235)抑制mTORC1和mTORC2。

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PI3K和mTOR抑制劑Dactolisib的生物活性

體外研究

Dactolisib(BEZ235)強(qiáng)力抑制PI3K，這是一種與ATP競爭的方式。Dactolisib(BEZ235)（250 nM）顯著降低了mTOR激活的蛋白激酶p70S6K的磷酸化水平。Dactolisib(BEZ235)還導(dǎo)致S235/S236P-RPS6級(jí)別降低，IC50為6.5 nM，暗示Dactolisib(BEZ235)可以直接抑制mTOR激酶，因?yàn)閙TOR的激酶領(lǐng)域與IA類PI3K的高度同源。使用生物化學(xué)mTOR K-LISA測定法證實(shí)了Dactolisib(BEZ235)對mTOR的活性（IC50，20.7 nM）。

Dactolisib(BEZ235)對HCT116、DLD-1和SW480細(xì)胞系的IC50分別為14.3±6.4、9.0±1.5和12.0±1.6 nM。

體內(nèi)研究

Dactolisib(BEZ235)（45 mg/kg，口服）治療在一個(gè)GEM模型中引起偶發(fā)的PIK3CA野生型CRC的結(jié)腸腫瘤退化。Dactolisib(BEZ235)（45 mg/kg）被口服給MENX大鼠（每組2只），并在治療后1或6小時(shí)犧牲動(dòng)物。對P-AKT和P-S6的免疫染色顯示出兩種蛋白質(zhì)的顯著減少，尤其是在Dactolisib(BEZ235)治療后6小時(shí)與PEG處理的大鼠比較時(shí)的P-S6。治療后6小時(shí)，Dactolisib(BEZ235)處理的大鼠的垂體腺瘤具有與安慰劑處理的大鼠的腫瘤明顯不同的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。

MCE并未獨(dú)立確認(rèn)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

實(shí)驗(yàn)參考方法

細(xì)胞檢測

HCT116(PIK3CA突變;H1047R位點(diǎn)的激酶結(jié)構(gòu)域),DLD-1(PIK3CA突變;E545K位點(diǎn)的螺旋結(jié)構(gòu)域),以及SW480(PIK3CA野生型)人源性大腸癌細(xì)胞系(ATCC)和同源DLD-1 PIK3CA突變和野生型細(xì)胞在DMEM中維持。細(xì)胞在不同初始密度下進(jìn)行種植(HCT116:每孔3000個(gè)細(xì)胞,DLD-1:每孔5500個(gè)細(xì)胞,SW480:每孔4500個(gè)細(xì)胞,DLD-1 PIK3CA突變:每孔7000個(gè)細(xì)胞,及DLD-1 PIK3CA野生型:每孔9000個(gè)細(xì)胞)以考慮到生長動(dòng)力學(xué)的差異。16小時(shí)后，細(xì)胞用不斷增加的BEZ235濃度(10,100,1000 nM)進(jìn)行孵育，每24小時(shí)更換含藥生長培養(yǎng)基。在最初種植后16小時(shí)和開始藥物處理后48小時(shí)，使用比色法的MTS試驗(yàn)CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay評(píng)估細(xì)胞活性。經(jīng)過藥物處理后的細(xì)胞活性被規(guī)范化為未處理的也生長了48小時(shí)的細(xì)胞。使用GraphPad Prism 5中的四參數(shù)非線性回歸計(jì)算IC50值。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

小鼠

患有腫瘤的Apc CKO小鼠被隨機(jī)分配進(jìn)行單獨(dú)的對照試劑（n=8）或每公斤體重45mg的BEZ235在10%的1-甲基-2-吡咯烷酮/90%PEG 300（n=8）中，通過每日口腔灌流進(jìn)行28天的治療。治療劑量是根據(jù)文獻(xiàn)指出每公斤體重40-50 mg的BEZ235可以有效地治療小鼠腫瘤模型而無不良反應(yīng)選擇的�；�于藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，在NVP-BEZ235給藥后一小時(shí)達(dá)到最大組織濃度，腫瘤攜帶的小鼠在最后的治療劑量后一小時(shí)被處死。用卡尺(width×length×height)評(píng)估結(jié)腸腫瘤體積，并收集腫瘤進(jìn)行western blot分析和免疫組織化學(xué)。

大鼠

使用MENX負(fù)面影響的大鼠。在MENX受影響的大鼠中，對BEZ235進(jìn)行了三個(gè)劑量的測試：20,30,和45 mg/kg。由于在治療10天后，兩個(gè)較高劑量導(dǎo)致體重下降超過10%，因此在進(jìn)一步的研究中使用了20 mg/kg的劑量。對于MRI研究，7到8個(gè)月的MENX影響的大鼠（具有可觀的腺瘤但仍然健康）用每天灌流BEZ235(20 mg/kg)或安慰劑(PEG)治療14天。

MCE并沒有獨(dú)立確認(rèn)這些方法的準(zhǔn)確性。它們僅供參考。