01背景介紹 
TMT全稱為串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tag），是基于質(zhì)譜MS2實(shí)現(xiàn)定量的同位素標(biāo)簽^[1]。TMT標(biāo)記試劑分子包括三個(gè)部分：用作MS2/MS3定量的報(bào)告離子、與肽段N端或者側(cè)鏈的賴氨酸結(jié)合的胺基反應(yīng)基團(tuán)、連接報(bào)告離子和氨基反應(yīng)基團(tuán)的質(zhì)量平衡基團(tuán)。質(zhì)量平衡基團(tuán)保證每個(gè)TMT分子的總分子量一致，而經(jīng)碎裂產(chǎn)生的報(bào)告離子分子量各有不同。因此，可以根據(jù)各自的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)不同樣品中相同多肽的定量比較。在母離子碎裂過程中，報(bào)告離子同時(shí)斷裂，相應(yīng)多肽的豐度便可以報(bào)告離子比值來表示。TMT定量方法目前最高可達(dá)18標(biāo)，可用于多條件比較，且定量穩(wěn)定性好，在蛋白質(zhì)組學(xué)定量中得到廣泛應(yīng)用。PEAKS Online支持TMT MS2/MS3定量分析及結(jié)果可視化。

02案例研究目的
儀器和數(shù)據(jù)采集方法的改進(jìn)極大地促進(jìn)了多通路標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)定量深度。本數(shù)據(jù)案例^[2]中，作者在Thermo Eclipse上使用三種不同的數(shù)據(jù)采集方法對相同的樣本分別分析，以展示real-time search (RTS)采集方法的優(yōu)勢。

圖1 定量分組

03實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
分別提取11種人類細(xì)胞系(RKO, A549, U87 MG, HCT116, HEK293T, HeLa, MCF7, U2OS, SUM159, PANC1, and Jurkat)的全蛋白提取、還原烷基化、Trypsin/LysC酶切，酶解肽段用TMT11plex試劑盒完成標(biāo)記后等量混合，然后通過高pH反向HPLC分為96個(gè)餾分，最終合并為24個(gè)，然后選擇互不相鄰的12個(gè)樣本在Eclipse上完成上機(jī)。數(shù)據(jù)采集使用了三種模式：MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3。

圖2 文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

04數(shù)據(jù)分析
我們下載了原文獻(xiàn)中的36個(gè)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)（MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3各12個(gè),SPS MS3只選擇90min梯度數(shù)據(jù)），在PEAKS Online中進(jìn)行分析，定量方法選擇軟件內(nèi)置的TMT11pelx（CID/HCD）,樣本間的校正選擇Auto normalization（Fig 3）。

圖3 校正方法

05三種采集方法的鑒定結(jié)果對比
從表1和圖4可以看出，MS2方法從定性定量到的蛋白、肽段數(shù)量上看，均優(yōu)于MS3的方法，但是據(jù)先前報(bào)道所述，MS2的定量準(zhǔn)確性比MS3低 ^[3]。因此我們進(jìn)行了不同采集方法間不同細(xì)胞系之間的定量比值。

圖4 三種采集方法定性定量結(jié)果對比

06不同細(xì)胞系之間蛋白定量的差異分析
蛋白定量結(jié)果展示如圖5。我們又深入對比了Human RelA-associated inhibitor（iASPP）在三種采集方法下，不同細(xì)胞系之間的TMT定量結(jié)果。為了消除偏差，選擇該蛋白下的相同肽段用作比較。

圖5 蛋白/肽段定量視圖

Human RelA-associated inhibitor(iASPP)是一種參與細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，通過抑制B細(xì)胞活化因子 NF-kappa-B和特異性蛋白1 (SP1)，阻斷HIV-1病毒的轉(zhuǎn)錄。在11個(gè)人類細(xì)胞系中，SUM159的iASPP豐度最高。然而，三種采集方法在SUM159中獲得的iASPP豐度比值存在顯著差異(圖6)：在RTS-SPS-MS3和SPS-MS3中分別為23.39和18.75，而在MS2采集方法中，該比值僅為7.52。在其他細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。一定程度上表明，TMT MS3能更準(zhǔn)確地揭示標(biāo)記通道之間的比值。

圖6 iASPP在不同細(xì)胞系中的定量比值。RKO設(shè)置為reference，理論比值為1.

07結(jié)論
PEAKS Online能完成各種復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的TMT標(biāo)記定量分析。

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08參考文獻(xiàn)
1.Thompson, A. et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry 75, 1895–1904 (2003)

2.Yu, Q. et al. Benchmarking the orbitrap tribrid eclipse for next generation Multiplexed Proteomics. Analytical Chemistry 92, 6478–6485 (2020).
3.Ting, L., Rad, R., Gygi, S. et al. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods 8, 937–940 (2011).

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