蛋白質(zhì)印跡(WB)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳解
WB，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、蛋白質(zhì)樣品制備：
原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
2.棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。
3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。
4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5.煮沸樣品5min。
6.離心12000g，5min，取上清。
二、SDS-PAGE電泳
一、清洗玻璃板；
二、灌膠與上樣：
1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。
2. 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
4. 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。
7. 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負(fù)極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至離底部1cm時(shí)，停止電泳。
三、轉(zhuǎn)膜
1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。 注意：若檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。
2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。
3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負(fù)極面(黑色面)。
4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對(duì)黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。
5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。
四、封閉與雜交
1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。
2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。
3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。
4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。
5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。
7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
8.15ml TBS洗1次。
六、顯色
將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、蛋白質(zhì)樣品制備：
原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
2.棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。
3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。
4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5.煮沸樣品5min。
6.離心12000g，5min，取上清。
二、SDS-PAGE電泳
一、清洗玻璃板；
二、灌膠與上樣：
1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。
2. 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
4. 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。
7. 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負(fù)極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至離底部1cm時(shí)，停止電泳。
三、轉(zhuǎn)膜
1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。 注意：若檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。
2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。
3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負(fù)極面(黑色面)。
4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對(duì)黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。
5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。
四、封閉與雜交
1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。
2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。
3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。
4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。
5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。
7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
8.15ml TBS洗1次。
六、顯色
將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。
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