類器官是由胚胎干細(xì)胞 (ESCs) 或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSCs) 衍生而來的體外 3D 細(xì)胞簇，與起源組織具有相似的組織學(xué)特征和功能。相比于傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)，類器官更具生理相關(guān)性，已被廣泛用于疾病研究和藥物開發(fā)。

盡管已有成熟的方法可以構(gòu)建腫瘤、腸道、心臟和視網(wǎng)膜等多種類器官，但目前的類器官通常僅包含單一種類細(xì)胞，缺少體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜性。

圖 1. 腸道類器官及腸上皮邊界的免疫細(xì)胞概述^[1]

A：腸道類器官培養(yǎng)缺乏腸上皮微環(huán)境的任何細(xì)胞成分。小鼠小腸類器官在體外自發(fā)產(chǎn)生兩個(gè)特化結(jié)構(gòu)域：隱窩樣結(jié)構(gòu)域 (The crypt-like domain) 和絨毛樣結(jié)構(gòu)域 (The villus-like domain)。B：穩(wěn)定狀態(tài)下在腸上皮邊界發(fā)現(xiàn)的常駐免疫細(xì)胞概述。腸上皮包含 αβ T 細(xì)胞受體 (TCR)⁺和 γδ TCR⁺上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞 (Intraepithelial lymphocytes, IELs)，而腸固有層包含不同亞群的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、產(chǎn)生 IgA 的漿細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞 (Innate lymphoid cells, ILCs) 等等。

雖然類器官仍存在以上種種局限性，但別慌！科學(xué)家們已開啟了“二代”類器官的新時(shí)代！話不多說，快來跟著小 M 來看看首次構(gòu)建的包含功能性免疫系統(tǒng)的體內(nèi)類器官吧~

近期，Carine Bouffi 等人 在 Nature Biotechnology 上發(fā)表了題為“In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice”的研究成果。
作者將人腸道類器官 (HIO) 移植到具有人源化免疫系統(tǒng)的小鼠 (NSGS) 的腎囊下，生成了含有免疫細(xì)胞的 HIO。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人類免疫細(xì)胞可暫時(shí)遷移到粘膜并形成類似于人類腸道淋巴濾泡的細(xì)胞聚集體。此外，接觸微生物后，上皮微褶皺細(xì)胞 (Microfold cells，M cell) 數(shù)量增加，導(dǎo)致 HIO 腔中 IgA 抗體的分泌并決定免疫細(xì)胞活化[7]。該文成功開發(fā)出“二代”腸道類器官(Next-generation HIO system)，下面，且聽小 M 來為大家細(xì)細(xì)解讀~

▐  模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)工作流程如下圖所示：

圖 2. 人源化小鼠模型驗(yàn)證述^[7]。

將體外 HIO 移植到人源化 (NSGS) 小鼠體內(nèi)，移植后第 12、16 和 20 周，收集 HIO 和目標(biāo)組織進(jìn)行分析 。注: NSGS 小鼠: NOD/Scid Il2rg null Tg (hIL3、hGM-CSF 和 hSCF) 小鼠。

a) 培養(yǎng)人 H1 胚胎干細(xì)胞：在 mTESR1 培養(yǎng)基中無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng) WA-01 細(xì)胞。

b) 誘導(dǎo)確定的內(nèi)胚層：用 Accutase 分離細(xì)胞，以每孔 7-10 萬 個(gè)的細(xì)胞密度鋪板于基質(zhì)膠包被的 24 孔板中。達(dá)到 80-95% 融合度時(shí)，用 100 ng/mL Activin A  處理 3 天。

c) 誘導(dǎo)中后腸球狀體形成：用含 500 ng/mL FGF4  和 3 μM CHIR-99021   的后腸誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理內(nèi)胚層 4 天。

d) HIO 生成：將球體鋪在基質(zhì)膠中，用含 100 ng/mL EGF  的腸道生長(zhǎng)培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)，至產(chǎn)生 HIO。

a) 將體外成熟 28 天的單個(gè) HIO 從基質(zhì)膠中取出，移植到人源化小鼠腎囊下 (具體手術(shù)方法可參考原文獻(xiàn))。

▐  類器官中腸細(xì)胞譜系驗(yàn)證

作者對(duì)移植的 HIO 進(jìn)行了腸道細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物染色，發(fā)現(xiàn)在 NSGS 小鼠中移植和分化的人腸道類器官中存在所有主要的腸道細(xì)胞譜系，證明了 HIO 的成功構(gòu)建和移植。

圖 3. HIO 移植到人源化小鼠體內(nèi)的腸細(xì)胞譜系表達(dá)^[7]。

HIO 移植后 12、16 和 20 周時(shí)，HIO 切片上的腸道標(biāo)志物 (紅色)、人 CD45 (綠色) 和人 CDH1 (白色) 在 (A) 腸上皮細(xì)胞標(biāo)志物 VIL/Villin、(B) 杯狀細(xì)胞標(biāo)志物 MUC2/Mucin2、(C) 潘氏細(xì)胞標(biāo)志物 LYZ/Lysozyme 和 (D) 腸內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物 CHGA/Chromogranin A) 的共染色。

▐  移植的 HIO 存在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

隨后，作者通過免疫組化 (IHC) 證明了移植的 HIO 固有層和上皮存在人免疫細(xì)胞 (hCD45+ 細(xì)胞) 浸潤(rùn) (圖 4A)，并形成與人類胎兒 (圖 4B) 或成人腸道免疫類似的細(xì)胞聚集體 (圖 4C)，說明移植的 HIO 中存在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和結(jié)構(gòu)。

圖 4. 使用免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型將免疫細(xì)胞整合到 HIO 中^[7]。

A：移植 HIO 后不同時(shí)間點(diǎn)用抗-人 CD45 抗體對(duì) HIO 進(jìn)行 IHC 染色; B: 用抗-人CDH1 抗體 (藍(lán)色)、抗-人 CD45 抗體 (綠色) 和 DAPI (白色) 對(duì)人胎兒腸道進(jìn)行免疫熒光染色; C: 用抗-人 CD45抗體對(duì)成人空腸進(jìn)行 IHC 染色。

作者還進(jìn)一步通過質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù) (一種將流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合在一起的新技術(shù)，用于高緯度和高通量單細(xì)胞分析）和免疫組化證實(shí) HIO 中存在 GALT 相關(guān) B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞 （參見原文 Fig 2, 3)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)移植 HIO 中淋巴樣結(jié)構(gòu)的時(shí)空發(fā)育與胎兒腸道中發(fā)育的淋巴濾泡相似，具體表現(xiàn)在 T 細(xì)胞/B 細(xì)胞聚集 (圖 5A)、分區(qū) (圖 5B)，粒細(xì)胞/漿細(xì)胞浸潤(rùn)等等 (圖 5C-E)。

圖 5. 移植的 HIO 中的淋巴樣結(jié)構(gòu)與胎兒腸道中的淋巴發(fā)育相關(guān)性比較^[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD3 抗體標(biāo)記 T 細(xì)胞 (上)，用抗人-CD4 /CD8 抗體標(biāo)記 T 輔助細(xì)胞/細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (中)，用抗人-CD20 抗體標(biāo)記 B 細(xì)胞 (下)。D: H&E 染色顯示發(fā)育后期 HIO 中的中性粒細(xì)胞。E: H&E 染色顯示漿細(xì)胞，并進(jìn)行 IHC 染色確認(rèn)。

▐  病原體侵染后的免疫應(yīng)答

圖 6. 移植的 HIO 暴露于病原體 (E.coli)后可誘導(dǎo) M 細(xì)胞產(chǎn)生^[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD45 抗體, 抗人-GP2 抗體, 抗人-MUM1 抗體分別標(biāo)記免疫細(xì)胞, M 細(xì)胞和漿細(xì)胞。D: GP2 基因表達(dá)變化。E: HIO 粘液中的人 IgA 水平變化。F:使用抗人-CDH1、抗人-GP2 和抗人-CD20 進(jìn)行免疫熒光染色。

本期小 M 為大家介紹了首例腸道“二代”類器官的構(gòu)建與驗(yàn)證。該研究一定程度上彌補(bǔ)了免疫相關(guān)研究的缺陷，為研究腸道發(fā)育、相關(guān)疾病和藥物發(fā)現(xiàn)的研究提供了更切實(shí)際的的模型。小 M 也相信這項(xiàng)研究也將為其他類器官領(lǐng)域的科學(xué)家們和同學(xué)們提供新思路~

MCE的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。
 

參考文獻(xiàn):
[1] Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Hans Clevers. Organoids in immunological research. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20(5): 279-293. 

[2] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.