瓊脂糖凝膠電泳實驗常見問題分析
瓊脂糖凝膠電泳已經(jīng)成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是分子生物學(xué)研究的重要方法，常用于DNA分型、鑒定DNA、RNA分子混合物、DNA核苷酸序列分析等技術(shù)，以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA 分子在電場中的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。
現(xiàn)在我們一起了解一下瓊脂糖凝膠電泳的工作原理和實驗中常見的問題和解決方法。
- 什么是電泳？
電泳是一種利用電流根據(jù)DNA、RNA或蛋白質(zhì)的物理特性（如大小和電荷）來分離它們的技術(shù)。
- 什么是瓊脂糖？
瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。將瓊脂糖粉末加熱到熔點后冷切凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度由瓊脂糖的濃度決定。
- 什么是瓊脂糖凝膠電泳？
瓊脂糖凝膠電泳是一種電泳形式，用于根據(jù)核酸（DNA或RNA）片段的大小進行分離。當(dāng)施加電流時，帶負(fù)電的DNA/RNA通過瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電的一端遷移，較小的片段遷移較快。由此產(chǎn)生的條帶可以用紫外線（UV）光來觀察。
- 瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧和注意事項
- 瓊脂糖凝膠溶液配制時總液體量不宜超過錐型瓶50%容量。否則會溢出。
- 加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
- 注意不要損傷梳底部的凝膠。一個是在拔梳子的時候，一個是在加樣時。
- 凝膠濃度越低（非常脆弱且難以處理），分辨的片段越大；凝膠濃度越高（很脆且可能凝固不均勻），分辨的片段越小。所以在制膠的時候要特別注意。
- 瓊脂糖凝膠電泳常見問題與異常分析
Q1：為什么marker條帶非常模糊，無法辨別具體條帶？
A1：出現(xiàn)上述情況，可能有以下幾個原因：
1. marker條帶出現(xiàn)了降解。請確保在使用過程中避免核酸酶污染；
2. 電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；
3. 電泳條件不合適。電泳時電壓應(yīng)不超過20V/cm，溫度應(yīng)低于30℃；
4. marker上樣量過多。請根據(jù)說明書選用合適上樣量；
5. 凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導(dǎo)致條帶模糊。
Q2：為什么marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則的條帶（如啞鈴狀等）？
A2：出現(xiàn)上述情況，多與以下幾個原因有關(guān)：
1. 電泳緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；
2. 電泳條件不合適。電泳時電壓應(yīng)不超過20V/cm，電壓太高可能也會導(dǎo)致marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象。此外，凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時凝固不均勻也會導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)。
Q3：為什么marker條帶非常弱或者根本沒有條帶？
A3：出現(xiàn)上述情況可能是：
1. marker上樣量較低，可適當(dāng)增加上樣量；
2. 凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒有條帶；
3. 電泳時間過長導(dǎo)致marker條帶跑出凝膠，可縮短電泳時間，降低電壓，增加凝膠濃度。
Q4：為什么marker缺帶？
A4：對于含有較小片段的marker，如果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象，可能是因為：
1. 小條帶跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶不易辨認(rèn)所致，可適當(dāng)縮短電泳時間，降低電壓，同時增加凝膠濃度；
2. 凝膠中染料含量過低，導(dǎo)致大片段結(jié)合染料量太少或沒有，在藍光儀下亮度太低，可適當(dāng)增加染料用量。
Q5：加樣孔出現(xiàn)熒光
1. 原因分析：大片段DNA的滯留；
2. 解決方法：樣品出現(xiàn)溢出，應(yīng)該通過降低模板量或濃度來處理；
Q6：條帶模糊或彌散
1. 原因分析：
（1）DNA發(fā)生降解；
（2）電泳緩沖液陳舊；
（3）電泳條件不合適；
（4）核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽分；
（5）染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散；
（6）PCR非特異性的擴增；
（7）加樣時操作不當(dāng)，樣品飄出樣孔；
2. 解決方法：
（1）更換緩沖液；
（2）根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當(dāng)?shù)碾妷哼M行電泳；
（4）電泳結(jié)束后及時觀察、拍照；
（5）DNA Maker進行對照，校正是否為電泳體系的問題；
（6）使用特異性較高的引物；
（7）降低電泳時的上樣量，并小心謹(jǐn)慎操作實驗；
Q7：無條帶或者弱條帶
- 原因分析：
（1）DNA的上樣量不夠；
（2）DNA發(fā)生降解；
2. 解決方法：
（1）增加上樣量；
（2）防止DNA降解，如：避免反復(fù)凍融樣品、避免核酸酶的污染。
Q8：DNA Marker降解
- 原因分析：
- 核酸酶污染；
- 保存不當(dāng)；
- 解決方法：
- 每次吸取時更換滅菌槍頭，勿將電泳緩沖液帶入管中、用后密閉4°C保存；
（2）4°C 或-20°C保存，避免多次反復(fù)凍融、不可加熱；
Q9：DNA Marker無正確分離
- 原因分析：
- 瓊脂糖質(zhì)量差；
- 電泳緩沖液多次使用后失效；
- 解決方法：
- 使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠；
- 更換緩沖液；
Q10：條帶缺失
- 原因分析：
- DNA條帶分子量過大；
- 分子量接近的DNA條帶沒有分開；
- 電泳緩沖液使用不當(dāng)；
- 電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠
- 電極插反，DNA走出凝膠
- 解決方法：
（1）使用脈沖凝膠電泳；
（2）選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進行電泳；
（3）SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的核酸片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的核酸片段；
（4）縮短電泳時間，調(diào)整電壓；
（5）正確連接電極方向；
Q11：條帶大小不正確
- 原因分析：
- 核酸降解或形成聚合物；
（2）λ DNA酶切Marker的cos位點復(fù)性；
（3）相同分子量的核酸片段由于結(jié)構(gòu)或序列的差異而有不同的遷移率；
（4）梳子變形，點樣孔不在同一水平線上；
2. 解決方法：
（1）加熱處理或重新制備樣品；
（2）電泳前65°C加熱5分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣；
（3）判斷核酸分子是否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺口、超螺旋、二聚體等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分子量富含GC堿基的核酸片段慢；
（4）使用完好的梳子制膠。
Q12：小片段擴散，條帶模糊，粗
- 原因分析：
- 錯誤選擇了低濃度凝膠，觀察大片段用低濃度凝膠,觀察小片段要用高濃度；
- 瓊脂糖質(zhì)量不好，質(zhì)量不好的瓊脂糖分離小片段容易擴散,即使是使用高濃度凝膠；
- 選擇了不合適的電泳緩沖液 ；
- 解決方法：
- 比如觀察100bp的小片段用2%凝膠跑電泳；
- 換用質(zhì)量好的瓊脂糖；
- SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的核酸片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的核酸片段。
Q13：條帶偏移扭曲
- 原因分析：
- 瓊脂糖凝膠配置出現(xiàn)問題；
- 凝膠未完全凝固；
- 凝膠在電泳槽中位置擺放偏移；
- 解決辦法：
- 應(yīng)準(zhǔn)確配置瓊脂糖凝膠，并充分進行凝固；
- 應(yīng)固定好凝膠在電泳槽中的位置，避免電泳過程中出現(xiàn)偏移；
上海領(lǐng)駿自主研發(fā)的磁珠法核酸提取試劑，可以提取高質(zhì)量的核酸DNA/RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，能夠得到清晰、明亮、完整的條帶，并且操作簡單快速，整個流程基本分為（裂解結(jié)合、洗滌、干燥、洗脫），大多數(shù)10-30min內(nèi)即可完成�？舍槍ρ�、血清/血漿、唾液、細(xì)菌、真菌、拭子、糞便、動植物組織、中草藥、石蠟包埋組織、PCR產(chǎn)物、測序反應(yīng)產(chǎn)物等樣本，分離純化高質(zhì)量基因組DNA/RNA、cfDNA、ctDNA或病毒核酸。
圖 新鮮yan葉DNA/RNA提取電泳圖
