前言

微生物發(fā)酵是一種利用微生物的生長和代謝活動來生產所需產品的技術。在微生物發(fā)酵過程中，我們通常會對一些工藝參數，如pH、溫度、溶氧、攪拌速度等進行在線檢測和控制。然而，判斷菌種生長狀況的生化指標如代謝產物、營養(yǎng)物質濃度等需要采用傳統(tǒng)的離線取樣方法。這種方法需要較長的取樣周期和復雜的實驗室操作，可能帶來潛在的污染風險。
 

原位拉曼光譜技術作為一種有效的過程分析工具（PAT），能夠實時監(jiān)控發(fā)酵過程中的關鍵參數，如營養(yǎng)成分、代謝產物、最終產品和細胞增長。這種過程監(jiān)測技術提供的數據有助于優(yōu)化發(fā)酵工藝，實現質量源于設計（QbD）的目標，從而確保產品高品質。

圖1 CloudReady™云平臺平行生物反應器 (1.5L)+原位拉曼光譜儀

迪必爾生物CloudReady™云平臺平行生物反應器采用了先進的D²MS數據和設備管理系統(tǒng)，支持OPC和Snap7協(xié)議，實現了與市場上絕大多數的PAT設備的無縫對接，進而監(jiān)控更為廣泛的關鍵過程參數。本次案例使用CloudReady™云平臺平行生物反應器整合ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀，完成大腸桿菌發(fā)酵過程中生化指標的在線監(jiān)測與反饋控制。

微生物發(fā)酵方案

在1.5L的CloudReady™云平臺平行生物反應器中進行大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如表1所示。在整個培養(yǎng)周期中，每隔2h進行離線取樣測量OD、碳源濃度（甘油）。同時，使用ReactRaman™ 原位拉曼光譜儀的探頭收集離線樣品的光譜，并上傳測量結果至配套的iC Raman分析軟件。軟件將各時間點的光譜與測量值一一對應，并建立預測模型。將探頭插入反應器中，作為在線PAT工具實時跟蹤OD和甘油濃度。


 

在線測量

甘油作為大腸桿菌碳源，其濃度會直接影響細胞的生長速率和代謝過程。由于滲透壓應激和代謝應激的存在，過高的甘油濃度可能會對大腸桿菌產生抑制作用。因此，測量甘油濃度并確保其處于適宜的低水平范圍對于維持細胞生長和代謝活性是必要的。實驗結果顯示甘油的離線數據與原位拉曼光譜儀的在線值之間的一致性(RMSE = 0.741g/L)。下圖表明，原位拉曼光譜儀作為在線PAT工具準確地反映了生物反應器內的微生物培養(yǎng)條件。
 

圖3 使用原位拉曼光譜儀獲得的甘油濃度與離線測量對比圖

OD（光密度）測量是估計培養(yǎng)物中細胞濃度的一種快速且簡便的方法。OD值與培養(yǎng)物中的細胞數量呈正相關，通過定期測量OD值，可以繪制出大腸桿菌的生長曲線。實驗結果顯示OD的離線數據與原位拉曼光譜儀的在線PAT值之間的一致性(RMSE = 4.926)
 

圖4 使用原位拉曼光譜儀獲得的OD與離線測量對比圖

反饋控制

如圖5所示，拉曼光譜技術能夠實現對多個關鍵技術指標的在線監(jiān)控。這一過程涉及將拉曼光譜數據實時傳輸至生物反應器，并與DCS等控制系統(tǒng)相結合。通過這種方式，可以利用控制系統(tǒng)的補料流加等模塊，對特定參數進行在線反饋控制。如圖5、圖6所示，D²MS上位機軟件與拉曼光譜儀支持使用OPC UA 協(xié)議將數據實時發(fā)送至控制系統(tǒng)。

圖5 基于D²MS系統(tǒng)的整合拉曼技術的自動反饋控制
 

圖6 D²MS實時獲取原位拉曼光譜儀參數

比生長速率是衡量單位時間內細胞濃度對數增長的指標。通過在不同時間點測定OD值，能夠估計出細胞數量的變化，并據此計算比生長速率，其常用公式為

𝜇=(ln(𝑂𝐷₂)−ln(𝑂𝐷₁))/Δt

·  μ 表示細菌的比生長速率;

·  OD₂ 是在時間t₂的最終光密度讀數;

·  OD₁ 是在時間t₁的初始光密度讀數;

·  Δt 表示兩次測量之間的時間間隔，即t₂-t₁。

在本次反饋控制策略中，使用原位拉曼光譜儀測量，CloudReady™每5分鐘獲取一次OD平均值。然后，將當前時間段內的平均OD值和前一個時間段的平均OD值代入上述公式連續(xù)計算每個5分鐘時間段的比生長速率。這些比生長速率隨后被劃分為低（0.00167至0.005）、中（0.005至0.01）和高（0.01至0.01667）三個不同區(qū)間，并據此進行分段反饋補料。不同區(qū)間的補料速率會根據各自的補料步長和峰值限制進行調整。此外，實時監(jiān)控甘油濃度，并將其與預設的閾值（1g/L）進行比較，以此協(xié)同控制補料速率。補料速率的調整如圖7
 

圖7  使用原位拉曼光譜儀反饋補料的過程趨勢圖

結論

本次實驗表明了利用強大的D²MS數據和設備管理系統(tǒng)將CloudReady™云平臺平行生物反應器與原位拉曼光譜儀進行協(xié)同作用，實現多個關鍵分析物的實時監(jiān)測并執(zhí)行反饋控制。生物反應器加上PAT工具可以通過實時在線的連續(xù)數據來加速對工藝過程的理解，可以進一步提升發(fā)酵過程工藝水平和自動化程度，并最終實現基于QbD（質量源于設計）的產品開發(fā)。

迪必爾生物 應用技術與工程研究中心（CARE）柴金言 許志國 供稿