抗體篩選鑒定流程及應(yīng)用范圍介紹
一、抗體鑒定：
1、抗體的效價鑒定：
鑒定效價的方法很多,包括有試管凝集反應(yīng),瓊脂擴散試驗,酶聯(lián)免疫吸附試驗等。常用的抗原所制備的抗體一般都有約成的鑒定效價的方法,以資比較。如制備抗抗體的效價,一般就采用瓊脂擴散試驗來鑒定。
2、抗體的特異性鑒定：
抗體的特異性是指與相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識別能力�？贵w的特異性高,它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率可用競爭抑制試驗測定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競爭抑制曲線,計算各自的結(jié)合率,求出各自在IC50時的濃度,并按公式計算交叉反應(yīng)率。
3、真核翻譯起始因子2C2抗體的親和力：
是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。親和力的高低是由抗原分子的大小,抗體分子的結(jié)合位點與抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。有助于維持抗原抗體復(fù)合物穩(wěn)定的分子間力有氫鍵,疏水鍵,側(cè)鏈相反電荷基因的庫侖力,范德華力和空間斥力。親和力常以親和常數(shù)K表示,K的單位是L/mol。
二、抗體篩選鑒定推薦流程：
1.包被免疫管：
將100ug 抗體加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度過夜孵育。
2.封閉：
將擴增和純化噬菌體文庫后的噬菌體 500ul 加入到1mL 3% BSA中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。同時往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。
3.抗原和噬菌體孵育：
將封閉后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗3次，每次5分鐘。將封閉后的噬菌體文庫加入到封閉后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h。
4.清洗：
將抗原和噬菌體孵育后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗20次，每次5分鐘。
5.洗脫：
往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室溫孵育10分鐘，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，將最后1.5mL的洗脫噬菌體轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
將洗脫的噬菌體按照擴增和純化噬菌體文庫 擴增后再重復(fù)篩選過程2次，逐次減半包被免疫管的抗體量，得到3次篩選后的洗脫噬菌體。
6.ELISA鑒定：
將上一步篩選得到的噬菌體稀釋10^6倍后，取100ul加入到OD600為0.5的SS320菌液中，37度培養(yǎng)30分鐘后涂布含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)板上，37度過夜培養(yǎng)第二天得到單克隆菌落。
挑選96個單克隆菌落到含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)液的96孔細胞培養(yǎng)板上，37度培養(yǎng)3-4小時后往培養(yǎng)孔中加入卡那霉素和20:1的輔助噬菌體，30度過夜培養(yǎng)。第二天將過夜培養(yǎng)后的細胞液離心，獲得上清液。
將過夜包被抗原和用3%BSA封閉過后的96孔ELISA板中加入上一步獲得的噬菌體上清液，室溫孵育1h。用含有0.05%吐溫的PBS清洗3次后，用噬菌體抗體抗體作為一抗，用相應(yīng)的二抗TMB顯色后在波長450讀取每個孔的吸光值。選取吸光值讀數(shù)最高的SS320菌落送去測序，得到抗體的基因序列。
三、應(yīng)用范圍：
1.用于細菌、病毒、梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等微生物的抗原或抗體檢查。
2.用于臨床自身免疫病的多種自身抗體熒光檢查，如抗核抗體，抗心肌抗體等。
3.細胞因子等檢查的熒光流式細胞儀測定。
4.白細胞分型抗原的免疫熒光染色。
5.免疫組織及免疫病理中抗原，抗體檢查，如各種腫瘤抗原檢查。
1、抗體的效價鑒定：
鑒定效價的方法很多,包括有試管凝集反應(yīng),瓊脂擴散試驗,酶聯(lián)免疫吸附試驗等。常用的抗原所制備的抗體一般都有約成的鑒定效價的方法,以資比較。如制備抗抗體的效價,一般就采用瓊脂擴散試驗來鑒定。
2、抗體的特異性鑒定：
抗體的特異性是指與相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識別能力�？贵w的特異性高,它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率可用競爭抑制試驗測定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競爭抑制曲線,計算各自的結(jié)合率,求出各自在IC50時的濃度,并按公式計算交叉反應(yīng)率。
3、真核翻譯起始因子2C2抗體的親和力：
是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。親和力的高低是由抗原分子的大小,抗體分子的結(jié)合位點與抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。有助于維持抗原抗體復(fù)合物穩(wěn)定的分子間力有氫鍵,疏水鍵,側(cè)鏈相反電荷基因的庫侖力,范德華力和空間斥力。親和力常以親和常數(shù)K表示,K的單位是L/mol。
二、抗體篩選鑒定推薦流程：
1.包被免疫管：
將100ug 抗體加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度過夜孵育。
2.封閉：
將擴增和純化噬菌體文庫后的噬菌體 500ul 加入到1mL 3% BSA中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。同時往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。
3.抗原和噬菌體孵育：
將封閉后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗3次，每次5分鐘。將封閉后的噬菌體文庫加入到封閉后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h。
4.清洗：
將抗原和噬菌體孵育后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗20次，每次5分鐘。
5.洗脫：
往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室溫孵育10分鐘，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，將最后1.5mL的洗脫噬菌體轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
將洗脫的噬菌體按照擴增和純化噬菌體文庫 擴增后再重復(fù)篩選過程2次，逐次減半包被免疫管的抗體量，得到3次篩選后的洗脫噬菌體。
6.ELISA鑒定：
將上一步篩選得到的噬菌體稀釋10^6倍后，取100ul加入到OD600為0.5的SS320菌液中，37度培養(yǎng)30分鐘后涂布含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)板上，37度過夜培養(yǎng)第二天得到單克隆菌落。
挑選96個單克隆菌落到含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)液的96孔細胞培養(yǎng)板上，37度培養(yǎng)3-4小時后往培養(yǎng)孔中加入卡那霉素和20:1的輔助噬菌體，30度過夜培養(yǎng)。第二天將過夜培養(yǎng)后的細胞液離心，獲得上清液。
將過夜包被抗原和用3%BSA封閉過后的96孔ELISA板中加入上一步獲得的噬菌體上清液，室溫孵育1h。用含有0.05%吐溫的PBS清洗3次后，用噬菌體抗體抗體作為一抗，用相應(yīng)的二抗TMB顯色后在波長450讀取每個孔的吸光值。選取吸光值讀數(shù)最高的SS320菌落送去測序，得到抗體的基因序列。
三、應(yīng)用范圍：
1.用于細菌、病毒、梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等微生物的抗原或抗體檢查。
2.用于臨床自身免疫病的多種自身抗體熒光檢查，如抗核抗體，抗心肌抗體等。
3.細胞因子等檢查的熒光流式細胞儀測定。
4.白細胞分型抗原的免疫熒光染色。
5.免疫組織及免疫病理中抗原，抗體檢查，如各種腫瘤抗原檢查。
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