PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法
PCR所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽(yáng)性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽(yáng)性問題。下面對(duì)其詳細(xì)分析：
一、假陰性
出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。
二、假陽(yáng)性
PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽(yáng)性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法：
PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個(gè)重要手段。擴(kuò)增片段的檢測(cè)和分析才是目的，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測(cè)的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測(cè)中，僅通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿足檢測(cè)的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測(cè)擴(kuò)增的情況，還可以用來純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
2、點(diǎn)雜交
當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測(cè)突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對(duì)人們認(rèn)識(shí)某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗(yàn)，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和地高辛等）標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡(jiǎn)便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測(cè)速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個(gè)雜交過程來檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高。該法已用于HBV的檢測(cè)，其敏感度可達(dá)5個(gè)HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡(jiǎn)便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測(cè)。因?yàn)?'端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個(gè)引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測(cè)。
一、假陰性
出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。
二、假陽(yáng)性
PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽(yáng)性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法：
PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個(gè)重要手段。擴(kuò)增片段的檢測(cè)和分析才是目的，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測(cè)的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測(cè)中，僅通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿足檢測(cè)的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測(cè)擴(kuò)增的情況，還可以用來純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
2、點(diǎn)雜交
當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測(cè)突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對(duì)人們認(rèn)識(shí)某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗(yàn)，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和地高辛等）標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡(jiǎn)便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測(cè)速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個(gè)雜交過程來檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高。該法已用于HBV的檢測(cè)，其敏感度可達(dá)5個(gè)HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡(jiǎn)便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測(cè)。因?yàn)?'端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個(gè)引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測(cè)。
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