熒光標(biāo)記指將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，具有無(wú)放射物污染、操作簡(jiǎn)便、容易觀察等優(yōu)點(diǎn)，可借助熒光特性對(duì)被標(biāo)記對(duì)象進(jìn)行定性、定位以及定量分析。熒光標(biāo)記在蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞檢測(cè)及免疫分析等方面顯現(xiàn)出巨大潛能。

表 1. 常見(jiàn)的用于蛋白偶聯(lián)反應(yīng)基團(tuán)。

反應(yīng)很多，本篇只講 NH₂ 和 SH 反應(yīng) ，在文章末尾小 M 會(huì)告訴大家基本的原理！在這里我們先來(lái)到大家最關(guān)注的環(huán)節(jié)：如何標(biāo)記蛋白？以及使用過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)？

染料標(biāo)記蛋白，主要包含以下步驟：

 

蛋白標(biāo)記時(shí)蛋白溶液的配制，以下幾點(diǎn)十分重要！  

• 關(guān)于溶解：溶解蛋白時(shí)，要根據(jù)推薦的溶劑進(jìn)行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或銨離子的緩沖液，它們與待標(biāo)記蛋白會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)降低標(biāo)記效率。低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會(huì)顯著干擾蛋白標(biāo)記，但是 20-50％ 的甘油會(huì)降低標(biāo)記效率。

• 標(biāo)記蛋白濃度：蛋白濃度過(guò)低會(huì)大大影響標(biāo)記效率，一般濃度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白濃度過(guò)低，可用超濾管濃縮蛋白。

注意事項(xiàng)：蛋白必須在不含伯胺和銨離子的緩沖液中，這些基團(tuán)會(huì)和蛋白爭(zhēng)奪結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)影響標(biāo)記效率。

蛋白溶液配好了，我們現(xiàn)在開(kāi)始配染料溶液，使用無(wú)水 DMSO 配制染料溶液 (多為 10 mM )，染料在 DMSO 穩(wěn)定性較好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分裝保存 1 個(gè)月。如果是水溶解，染料有易被水解的性質(zhì)，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

我們?cè)跇?biāo)記時(shí)，首要注意的是染料和蛋白的配比問(wèn)題，染料過(guò)少，反應(yīng)不完全，標(biāo)記量太少，染料過(guò)多，則不易純化。通常，我們推薦染料與蛋白的摩爾比在 5:1-20:1。
 
 

 案例：

此處我們以 CY3 為例，假如所需標(biāo)記蛋白為 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 µL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，則所需 CY3 體積為 3.95 μL，詳細(xì)計(jì)算流程如下：

1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol

2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol

3)µL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/µL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/µL =3.95 µL 

 

 

了解配比后，我們開(kāi)始孵育，一般將染料和蛋白一起室溫孵育 2 h 即可完成結(jié)合！

熒光標(biāo)記結(jié)束后，我們需要純化蛋白去掉多余未結(jié)合染料防止其對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，常用的純化工具為親和層析柱和透析袋。

表 2. 層析柱和透析袋的對(duì)比。

 

忙忙碌碌終于大功告成，那么如何檢測(cè)我們是否標(biāo)記成功呢，通常是以下幾種：

• 直接肉眼觀察，根據(jù)上面的純化原理可以得知，如果得到的產(chǎn)物有顏色。我們默認(rèn)標(biāo)記成功；

• 熒光顯微鏡觀察，通過(guò)熒光顯微鏡在對(duì)應(yīng)通道進(jìn)行拍攝，如果觀察到特定形態(tài)熒光信號(hào)即為標(biāo)記蛋白；

• 蛋白電泳實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記后蛋白本身分子量會(huì)增大，蛋白存在微小向上拖帶可以證明標(biāo)記成功（如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發(fā)生降解）。

• 使用分光光度計(jì)測(cè)定 F（熒光素）和 P（抗體蛋白）的比值（F/P），F(xiàn)/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質(zhì)量，一般要求 F/P 的克分子比值為1～3。過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱，標(biāo)記效率低。

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下面是原理解答時(shí)間！

• 關(guān)于蛋白氨基反應(yīng)

伯胺 (-NH₂) 存在于每條多肽鏈的 N-末端 (稱(chēng)為 α-氨基) 以及賴(lài)氨酸殘基的側(cè)鏈中(稱(chēng)為 ε-氨基)。由于伯胺在生理?xiàng)l件下帶正電荷，因此它通常朝外，使得其更易于偶聯(lián)而不會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。從我們的表中可以看出，許多反應(yīng)基團(tuán)均可以和伯胺基結(jié)合，而在熒光標(biāo)記中，最常用的是還是 NHS 活化酯 (SE)[1]。

圖 1. NHS 酯圖示。

NHS 活化酯 (SE)
NHS，全稱(chēng)為 N -羥基琥珀酰亞胺酯，是 EDC (碳二亞胺) 活化羧酸分子形成的反應(yīng)基團(tuán)。帶有活化的 NHS 酯的交聯(lián)劑 和標(biāo)記化合物在弱堿性條件下與伯胺反應(yīng)， 產(chǎn)生穩(wěn)定的酰胺鍵 (圖 3)。該反應(yīng)釋放 N-羥 基琥珀酰亞胺 (NHS)，可通過(guò)透析或脫鹽輕易去除[2]。

• 關(guān)于蛋白巰基反應(yīng)

巰基 (-SH) 存在于半胱氨酸的側(cè)鏈中。在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，必須將其還原成巰基，使其可以與大多數(shù)類(lèi)型的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)。巰基對(duì)馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙酰基和吡啶二巰基具有反應(yīng)活性，在蛋白巰基標(biāo)記中，馬來(lái)酰亞胺的熒光探針最為常見(jiàn)[3]。

圖 3. 馬來(lái)酰亞胺圖示。

馬來(lái)酰亞胺（Maleimides） 
馬來(lái)酰亞胺是一種非常常用的反應(yīng)活化基團(tuán)，當(dāng)反應(yīng)混合物的 pH 值在 6.5-7.5 之間時(shí)，馬來(lái)酰亞氨基團(tuán)會(huì)與巰基基團(tuán)特異性反應(yīng)，形成不可逆的穩(wěn)定硫醚鍵。在堿性更強(qiáng)的條件下（pH>8.5），支持伯胺偶聯(lián)，并且還會(huì)增加馬來(lái)酰亞氨基團(tuán)水解成非反應(yīng)性馬來(lái)酰胺酸的速率。馬來(lái)酰亞胺不與酪氨酸、組氨酸或蛋氨酸反應(yīng)。需要注意的是，馬來(lái)酰亞胺酯是一種非活化染料，使用帶有馬來(lái)酰亞胺酯的熒光探針時(shí)，需用 DTT 活化后方可進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記[4]。

[1] Mattson G, et al. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep. 1993 Apr;17(3):167-83. 
 
[2] Grabarek Z, et al. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal Biochem. 1990 Feb 15;185(1):131-5. 

 

[3] Staros JV, et al. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal Biochem. 1986 Jul;156(1):220-2. 

 

[4] Timkovich R. Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal Biochem. 1977 May 1;79(1-2):135-43.