摘要
我們使用細胞活性測定來研究生物活性分子的效力或毒性。而發(fā)光 CellTiter-Glo® (CTG) 檢測一種廣泛用于測量細胞活性的技術。 它是一種基于 ATP 定量的均相方法，ATP 是代謝活躍細胞的指標。然而，在需要延長培養(yǎng)時間的多個時間點的細胞活性研究中，CTG 往往會變干并形成堵塞物。在本研究中，我們檢查和比較了使用兩種試劑分配器 - Multidrop® Combi (ThermoFisher) 和 TEMPEST® (FORMULATRIX®) - 進行的長時間培養(yǎng) CTG 檢測的結果。
 
介紹
CellTiter-Glo 是一種常用的細胞活性檢測方法，可將 ATP 水平量化為代謝活動的指標。測定的同質“添加-混合-檢測”形式使其非常適合自動化。但是，重構的 CellTiter-Glo 試劑是一種濃縮的預混液，如果干燥，很容易堵塞分液器。這對延長細胞培養(yǎng)時間的自動化測定提出了挑戰(zhàn)，因為在培養(yǎng)期間分液器保持待機狀態(tài)，很容易堵塞并需要人工處理解決。
 
Multidrop® Combi 是一款廣泛使用的快速八通道蠕動分液器，在分配 2 μL 液體時一般具有的 ±10% 的不準確度和不精確度。
 
TEMPEST（圖 1）是一款非接觸式液體分配器，可配置多達 12 個微型隔膜芯片，這些芯片分液由多達 96 個獨立控制的噴嘴共同完成。 TEMPEST 芯片與多種試劑兼容，粘度高達 25 cP（70% 甘油，20 C），能夠以高精度和高精度分配小體積溶液（表 1）。  
芯片的設計實現了試劑的雙向運動：a) 從儲液器通過噴嘴分配 b) 在噴嘴關閉的情況下在儲液器和芯片之間進行再循環(huán)。即使在儀器沒有分液的情況下，TEMPEST 的再循環(huán)功能也能保證芯片內的液體移動，使滯留體積中的懸浮液保持均勻并防止其堵塞管道（圖 2）。  
   
材料和方法
通過 TEMPEST 或 Multidrop Combi，我們將 SNU-1 細胞接種在 1536 孔板（Corning #3893）中的 5 μL 培養(yǎng)基中。將板在 37°C、98% 相對濕度和 5% CO2 條件下培養(yǎng)長達 72 小時。 對于 CTG 測定 (Promega)，我們在每孔中加入 1 μL 的 CTG，使用與細胞接種相同的儀器。 我們研究了兩個時間點：1) 時間 = 0（將細胞添加到微孔板后一小時內）和 2) 時間 = 72 小時。 在時間 = 0 時，我們使用新鮮的 CTG。在時間 = 72 小時時，我們進行了兩個實驗：1) 使用新鮮的 CTG，和 2) 使用留在已充注儀器上過夜（16 小時）的 CTG。 我們使用 Envision (PerkinElmer) 對微孔板成像，并用 ActivityBase (IDBS) 分析細胞代謝活性。
 
結果和討論
根據我們的經驗，Multidrop Combi 能夠在日常操作中始終如一地提供準確和精確的分液，其中能對大量微孔板進行快速連續(xù)分液。我們以使用新鮮 CTG 的時間 = 0 點為例說明了該觀察結果（圖 2，左）。另一方面，使用 TEMPEST 進行的檢測表現出略低的離散度，其中高于零抑制的孔較少（圖 2，右）。這可能是由于微隔膜分液技術比蠕動技術京都更高。
   
在時間 = 72 小時使用新鮮 CTG 進行的細胞活性測定中，使用 Multidrop Combi 的效果還是和預期一樣。 Multidrop Combi（圖 3，左）和 TEMPEST（圖 3，左）的信號背景比 (S/B) 相當，分別計算為 345 和 408。 相似的 S/B 比率表明平板上的細胞處于相同的代謝活動水平，表明這兩種儀器對長期細胞活性具有相同影響或是沒有影響。然而，兩種儀器之間的數據離散度差異甚至比時間 = 0 時更大，TEMPEST 的 Z' = 0.7，而 Multidrop Combi 的 Z' = 0.56，這正好解釋了使用 TEMPEST 進行分析時信號背景比和前者相比高約 18% 。
   
當 CTG 保留在儀器上過夜時，情況發(fā)生了巨大變化。 Multidrop Combi 管道堵塞，無法獲得數據，而 TEMPEST 的再循環(huán)功能則完全避免了這一情況。此外，使用 TEMPEST 處理新鮮 CTG 的產生的數據（圖 3，左）與使用過夜 CTG （圖 3，右）獲得的數據幾乎沒有區(qū)別。這種一致性令人驚訝，因為根據制造商的說法，重構的 CTG 試劑可以在室溫下儲存長達八小時，以將活性損失保持在 10% 以下。一種可能的解釋是通過再循環(huán)頻繁混合可延長 CTG 試劑的半衰期。
   
結論
我們通過 TEMPEST 或 Multidrop Combi 分液器實施 CellTiter-Glo 測定法對細胞活性進行研究。兩種儀器之間的數據具有可比性，但是使用 TEMPEST 進行分液的試驗從時間 = 0 開始始終具有較低的離散度。時間 = 72 小時使用 TEMPEST 分配新鮮 CTG 的試驗有著更高的 Z` 和高約 18% 信號背景比。 當 CTG 在儀器上放置過夜時，它會堵塞 Multidrop Combi 管道，因此無法獲得數據。然而，TEMPEST 的再循環(huán)功能可防止 CTG 在一夜之間變干并堵塞芯片，生成的數據幾乎與使用新鮮 CTG 獲得的數據相同。
 
總體而言，具有再循環(huán)功能的 TEMPEST 非常適合高通量全自動 CTG 分析，無需在機器待機期間進行人為處理。這些觀察結果表明，Tempest 的使用可以更廣泛地擴展到涉及分配沉淀懸浮液、需要穩(wěn)定的非環(huán)境溫度的試劑以及干燥時會堵塞的高濃度溶液的工作流程。該研究還表明，TEMPEST 的分液足夠溫和，可用于分配細胞懸液。
 
致謝
這項研究是與 Forma Therapeutics 合作進行的。 Forma 現在是 Novo Nordisk 的一部分，是一家臨床階段的生物制藥公司，專注于新療法的開發(fā)和商業(yè)化，以改變罕見血液病和癌癥患者的生活。他們藥物研發(fā)的專業(yè)知識創(chuàng)造了一系列小分子候選產品，專注于未滿足患者需求的適應癥。