ROC-325 是一種有效的具有口服活性的自噬 （autophagy） 抑制劑，具有很強(qiáng)的抗癌活性。ROC-325 引起溶酶體脫酸，自噬體積累和自噬通量中斷。ROC-325 還誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌凋亡 （apoptosis）。

 

 

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　　體外研究

 

　　ROC-325以atg5 /7依賴的方式拮抗腎細(xì)胞癌（RCC）的生長和存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出良好的選擇性。ROC-325對A498、A549、CFPAC-1、COLO-205、dlc -1、ig羅夫-1、MCF-7、MiaPaCa-2、NCI-H69、PC-3、RL和UACC-62細(xì)胞的IC50分別為4.9 μM、11 μM、4.6 μM、5.4 μM、7.4 μM、11 μM、11 μM、5.8 μM、5.0 μM、11 μM、8.4 μM和6.0 μM。ROC-325誘導(dǎo)自噬抑制的標(biāo)志性特征并拮抗自噬通量。

 

　　ROC-325引發(fā)組織蛋白酶D （CTSD）水平的顯著升高。5 μM ROC-325處理24小時(shí)可導(dǎo)致A498和786-0 RCC細(xì)胞中LC3B點(diǎn)的形成和LC3B水平的顯著增加。在A498和786-0細(xì)胞中進(jìn)行的免疫印跡分析表明，ROC-325促進(jìn)LC3B表達(dá)的劑量依賴性增加，其方式與p62和組織蛋白酶D水平的相應(yīng)增加相關(guān)。

 

 

　　體內(nèi)研究

 

　　口服ROC-325 （25 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg）給786-0 RCC異種移植物小鼠耐受性良好，在抑制腫瘤進(jìn)展方面明顯比羥氯喹更有效，并能抑制體內(nèi)自噬。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

 

 

　　用ROC-325孵育腎癌細(xì)胞24小時(shí)。細(xì)胞被收獲，然后被溶解。從每個(gè)樣品中提取約50 μg的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并用5%脫脂乳在含有0.1% Tween-20的tris緩沖鹽水溶液中阻斷膜1小時(shí)。然后用一抗在4°C下探針過夜，洗滌，并用偶聯(lián)的種特異性二抗探針辣根過氧化物酶。免疫反應(yīng)性物質(zhì)通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

 

　　通過MTT法估計(jì)細(xì)胞活力。細(xì)胞被播種到96孔的微培養(yǎng)皿中，每孔10000個(gè)細(xì)胞，并允許附著24小時(shí)。然后用ROC-325處理細(xì)胞72小時(shí)。ROC-325處理后，加入MTT，用酶標(biāo)儀定量甲醛吸光度。通過將各自的甲醛光密度歸一化到對照細(xì)胞的密度，計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下估計(jì)的細(xì)胞活力。通過碘化丙啶（PI）染色和熒光活化細(xì)胞分選（FACS）分析亞g0 /G1 DNA含量，以及使用商業(yè)試劑盒流式細(xì)胞術(shù)測量活性caspase-3，定量分析ROC-325體外暴露后的促凋亡作用。同靶點(diǎn)產(chǎn)品推薦：Bafetinib是Bcr-Abl抑制劑

 

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　　786-0腎癌細(xì)胞（5×106）懸浮在HBSS和Matrigel的混合物中，皮下植入雌性裸鼠。每種細(xì)胞系異種移植的荷瘤動(dòng)物被隨機(jī)分為治療組。小鼠用載藥（水）、ROC-325（25、40和50 mg/kg PO） QD×5治療6周。每天監(jiān)測小鼠，每周測量兩次腫瘤體積。在研究結(jié)束時(shí)，從每組有代表性的動(dòng)物中切除腫瘤，用福爾馬林固定，石蠟包埋進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。

 

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