腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth neuropathies，CMT）是一組臨床上常見(jiàn)的周?chē)�神�?jīng)遺傳病，發(fā)病率約為1/2500。根據(jù)致病基因的不同， CMT可分為幾十種不同的亞型。就CMT患者總數(shù)而言，在全國(guó)范圍內(nèi)是一個(gè)非常龐大的數(shù)字，然而具體到某些亞型的患者數(shù)量卻非常稀少，因此CMT被收錄到國(guó)家《第一批罕見(jiàn)病名錄》。

長(zhǎng)久以來(lái)令人困惑的是，這幾十種CMT致病蛋白在細(xì)胞中的定位和生理功能各異，似乎沒(méi)有任何明顯的共性，然而這些突變蛋白卻會(huì)導(dǎo)致CMT患者表現(xiàn)出非常相似的臨床癥狀。這個(gè)被稱(chēng)之為“疾病遺傳異質(zhì)性”的謎團(tuán)長(zhǎng)期以來(lái)一直困擾著廣大神經(jīng)科學(xué)家和臨床工作者。有沒(méi)有可能不同的致病蛋白最后通過(guò)一個(gè)“殊途同歸”的共同機(jī)制引發(fā)相似癥狀？

在過(guò)去幾十年的研究中，領(lǐng)域內(nèi)逐漸形成了一個(gè)共識(shí)：大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生都是遺傳因子和環(huán)境應(yīng)激因子共同作用的結(jié)果^{[1, 2]}。當(dāng)細(xì)胞面臨各種不良環(huán)境刺激時(shí)（如營(yíng)養(yǎng)缺乏、高溫、輻射等），細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的應(yīng)激機(jī)制就是形成應(yīng)激顆粒（Stress granule，SG），SG的形成可以避免蛋白的錯(cuò)誤翻譯，有效地組織利用細(xì)胞中各種信號(hào)分子和能量資源，使細(xì)胞更好地應(yīng)對(duì)環(huán)境中的不良刺激，提高細(xì)胞存活率^{[3, 4]}。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，SG在多種神經(jīng)退行性疾病中扮演了非常關(guān)鍵的角色，其功能主要是與肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)疾病中蛋白沉淀的形成相關(guān)^[5-7]，而CMT是不產(chǎn)生蛋白沉淀的周?chē)�神�?jīng)病，應(yīng)激顆粒是否參與到CMT疾病中尚未有研究^[8-10]。



2023年2月3日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦科學(xué)與腦醫(yī)學(xué)學(xué)院白戈課題組與合作者在Cell雜志( IF=66.850 (2022) / JCR分區(qū): Q1 )以封面文章形式在線(xiàn)發(fā)表了題為“Diverse CMT2 Neuropathies are Linked to Aberrant G3BP Interactions in Stress Granules“ 的研究論文。該工作發(fā)現(xiàn)雖然在正常生理狀態(tài)下不同CMT致病蛋白在細(xì)胞中的定位各異，但在應(yīng)激狀態(tài)下這些CMT致病蛋白會(huì)表現(xiàn)出相同的細(xì)胞定位，進(jìn)入應(yīng)激顆粒中并與其核心蛋白G3BP發(fā)生異常互作，引起應(yīng)激顆粒異常，使得周?chē)�神�?jīng)應(yīng)對(duì)環(huán)境不良刺激的能力下降，從而導(dǎo)致周?chē)�神�?jīng)病的發(fā)生。



該研究首先使用浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公用技術(shù)平臺(tái)Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡，在HeLa細(xì)胞、雞胚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和小鼠原代培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中確定了導(dǎo)致CMT2D亞型的GlyRS蛋白能夠在應(yīng)激狀態(tài)下進(jìn)入到應(yīng)激顆粒中（圖1），同時(shí)利用該顯微鏡的時(shí)間序列和FRAP成像模塊獲得數(shù)據(jù)揭示了GlyRS致病蛋白對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)長(zhǎng)度影響及GlyRS致病蛋白對(duì)應(yīng)急顆粒動(dòng)態(tài)性的影響。

圖1. GlyRS蛋白在應(yīng)激下定位到SG中。A-C：HeLa細(xì)胞中野生型和突變型的GlyRS蛋白在應(yīng)激狀態(tài)下進(jìn)入到SG中，并與SG核心蛋白G3BP1發(fā)生共定位。D-F：在雞胚脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中驗(yàn)證體內(nèi)GlyRS與G3BP1蛋白共定位。G-I：在小鼠原代培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中確定了內(nèi)源性GlyRS與G3BP1蛋白發(fā)生共定位。

隨后研究人員通過(guò)活細(xì)胞熒光成像、鄰近標(biāo)記、定量蛋白質(zhì)譜、STORM超分辨成像等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，GlyRS突變蛋白與G3BP的異常相互作用不會(huì)影響SG組裝-解聚的動(dòng)態(tài)變化，卻會(huì)顯著干擾以G3BP為核心的SG蛋白網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致大量非SG組分異常滯留在SG中，從而擾亂了細(xì)胞正常的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抵御外界不良環(huán)境刺激的能力明顯下降，更易發(fā)生軸突退變（圖2）。

研 究 人 員 還 進(jìn) 一 步 鑒 定 出 了 GlyRS 突 變 蛋 白 與 G3BP 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 位 于 其 “ 內(nèi) 在 無(wú) 序 區(qū) ”（Intrinsically disordered region, IDR），通過(guò)破壞二者的異常結(jié)合，能夠消除GlyRS突變蛋白對(duì)SG的干擾，改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抵抗不良環(huán)境刺激的能力，有效緩解CMT2D小鼠模型的疾病癥狀 （圖2）。

圖2. 不同CMT2蛋白的共性致病機(jī)制。

綜上，該工作揭示了應(yīng)激顆粒異常是介導(dǎo)不同亞型CMT的共同致病機(jī)制，為針對(duì)多亞型CMT的廣譜治療藥物的開(kāi)發(fā)提供了重要理論基礎(chǔ)，也為其他疾病遺傳異質(zhì)性的機(jī)制研究提供了新的思路。

本文中多色熒光標(biāo)記的細(xì)胞圖像都是采用Olympus激光掃描共聚焦FV3000拍攝。FV3000的全真光譜技術(shù)可以自由調(diào)整標(biāo)記熒光信號(hào)的收集波段，并有效防止不同標(biāo)記之間的熒光串?dāng)_，幫助用戶(hù)獲取更加真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)。另外，本文還利用FV3000觀察了活細(xì)胞中的G3BP1液滴以及通過(guò)FRAP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其相分離特性。FV3000靈活高效的龍卷風(fēng)光刺激模式以及追蹤運(yùn)動(dòng)中的液滴并分析其漂白區(qū)域熒光強(qiáng)度變化的功能，是幫助用戶(hù)進(jìn)行相分離研究的利器。
 

浙江大學(xué)雙腦中心、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦科學(xué)與腦醫(yī)學(xué)學(xué)院白戈研究員與中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心李勁松院士為本文的共同通訊作者。博士后崔琴琴、畢洪運(yùn)、呂占云，博士生武琪貴、華劍鋒、谷博凱為本文共同第一作者，博士后霍嬋娟、唐明敏等也為本研究做出重要貢獻(xiàn)。本研究還得到了劉華清、楊培國(guó)、金志剛、吳志英、章永登、沈承勇、盛能印等教授的大力支持，并得到了段樹(shù)民院士、胡海嵐、景乃禾、李黨生、唐北沙、張宏、楊兵、蔣超、張軻、孫啟明、彭廣敦、郭天南、張如旭、劉聰、陳萬(wàn)金、趙國(guó)華、Sam Pfaff（Salk Institute）、Xiang-Lei Yang（TSRI）等教授的指導(dǎo)和幫助。該研究主要受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金委“原創(chuàng)探索計(jì)劃”、“器官衰老與器官退行性變化的機(jī)制”重大研究計(jì)劃、科技創(chuàng)新2030重大項(xiàng)目等資助。

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