常用的細(xì)胞活力檢測(cè)試劑主要有 MTT、CCK8 等檢測(cè)方法 (圖 1)。

MTT法：又稱 MTT 比色法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 (Formazan) 并沉積在細(xì)胞中，但死細(xì)胞無(wú)此功能，后經(jīng) DMSO 溶解，于 490 nm 處測(cè)定吸光值便可間接反應(yīng)細(xì)胞活力。但該方法除去操作步驟耗時(shí)以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需經(jīng) DMSO 溶解后才能檢測(cè)，增加了工作量的同時(shí)仍不能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，且該溶劑對(duì)人體具有明顯毒性。

CCK8法：相較于 MTT，無(wú)論是操作步驟還是檢測(cè)時(shí)間都優(yōu)化了很多。CCK8 是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無(wú)放射性的比色檢測(cè)方法(可看往期推文 CCK-8，讓細(xì)胞活性檢測(cè) So Easy!)。但在實(shí)驗(yàn)時(shí)，一直有個(gè)問(wèn)題讓人很困擾——“細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺”，但這個(gè)顏色深淺的標(biāo)準(zhǔn)我 “標(biāo)” 不出來(lái)怎么辦？痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！

 
 

 科研汪 ：MTT 作為“元老”級(jí)別的檢測(cè)方法，雖然“老練”，Paper 無(wú)數(shù)，但麻煩是真麻煩，CCK8 法倒是便捷很多！

 小 M：那你是還沒(méi)用過(guò)更便捷的...

 科研汪 ：莫非你說(shuō)的是細(xì)胞活力檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”？

 小 M：CTG 細(xì)胞活力檢測(cè)，簡(jiǎn)單、靈敏、快速的均質(zhì)檢測(cè)方法，反應(yīng) 10 分鐘即可得到“Bling Bling”的檢測(cè)結(jié)果，你就說(shuō)“快不快”？

 

CTG 發(fā)光法：基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì)三磷酸腺苷 (ATP) 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。該實(shí)驗(yàn)方法可用三個(gè)字簡(jiǎn)單概括 “快、準(zhǔn)、狠”，比 MTT 的處理速度快近 20 倍，節(jié)省時(shí)間近 4 小時(shí)。CTG 特有的均質(zhì)檢測(cè)法即 “加樣-混樣-檢測(cè)”，使用時(shí)，只需將本試劑等體積添加至培養(yǎng)細(xì)胞中即可進(jìn)行檢測(cè)。不用感慨，細(xì)胞活力檢測(cè)為什么不能如此簡(jiǎn)單？

 

 

圖 1. MTT、CCK8 與 CTG 法的實(shí)驗(yàn)流程圖

 
表 1. MTT、CCK8 與 CTG 法特點(diǎn)比較
 

 
首先，來(lái)了解實(shí)驗(yàn) CTG 發(fā)光法的測(cè)定原理：ATP 作為細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，與活細(xì)胞數(shù)目呈良好的線性關(guān)系，是細(xì)胞活力檢測(cè)的重要標(biāo)志性分子。
ATP 生物發(fā)光的原理為：熒光素酶以熒光素、ATP 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時(shí)，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能；在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，即在光信號(hào)與酶反應(yīng)體系中，發(fā)光值與 ATP 呈正比，ATP 與活細(xì)胞數(shù)成正比，CTG 發(fā)光法通過(guò) ATP 含量來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)或活力測(cè)定，且不受化合物自發(fā)熒光的影響 (圖 2)，是細(xì)胞增殖測(cè)定，細(xì)胞活力測(cè)定和細(xì)胞毒性高通量篩選分析的理想選擇。

圖 2. CTG 法檢測(cè)原理 

■ 案例 1：細(xì)胞增殖測(cè)定

如圖 3 所示，為了探究 SIPL1 對(duì) TNBC 細(xì)胞增殖的影響，將 SIPL1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至 BT-549 與 MDA-MB-231 細(xì)胞， 并使用 CCK8 法與 CTG 法，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。
 

CCK-8 檢測(cè)：TNBC 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 shRNA 或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并培養(yǎng) 24 h 后檢測(cè)。

CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定：TNBC 細(xì)胞在 37°C 下培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將 100 µL CTG 溶液直接與培養(yǎng)基混合，在室溫下培養(yǎng) 20 分鐘。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞系的細(xì)胞增殖顯著降低 (圖 3)。

圖 3. SIPL1 對(duì) TNBC 細(xì)胞活力的影響^[1]

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定 (b) 用指示載體轉(zhuǎn)導(dǎo) BT-549 和

MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的分析。

 

■ 案例 2：細(xì)胞活力測(cè)定

如圖 4 所示，為了探究外源 RRM2 是否會(huì)影響肝癌細(xì)胞的鐵死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲除 RRM2，通過(guò) CTG 法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá) RRM2 時(shí)，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，反之，敲除 RRM2 時(shí)，細(xì)胞活力明顯降低^[1]。

 

 

圖 4. 通過(guò) CTG 法測(cè)定 RRM2 對(duì)細(xì)胞活力的影響^[2]

(a) 在體外表達(dá)或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或體外表達(dá)的 RRM2 進(jìn)行進(jìn)一步處理。細(xì)胞活力測(cè)定采用 CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定法。

 

■ 案例 3：細(xì)胞毒性高通量篩選分析

如下圖所示，作者團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種基于濃度-反應(yīng)曲線的表型定量高通量篩選 (qHTS)，旨在識(shí)別對(duì)瘧原蟲(chóng)肝臟和無(wú)性血期寄生蟲(chóng)具有活性的化合物 (圖 5)。使用 SYBR Green 或熒光素酶來(lái)測(cè)試對(duì)寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)的抑制，共檢測(cè)了 456,817 種化合物。

在 qHTS 之后，又分類選擇了 4,253 種合成易處理的化合物，用于驗(yàn)證抗瘧原蟲(chóng)活性和哺乳動(dòng)物毒性。在 3 μM 和 1 μM 濃度下對(duì)化合物進(jìn)行體外抗伯氏瘧原蟲(chóng)肝期寄生蟲(chóng)的評(píng)估。其中使用 CTG 法評(píng)估了所有 4,253 種化合物對(duì) HepG2 的細(xì)胞毒性。其中 255 種化合物對(duì) HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度的生長(zhǎng)細(xì)胞毒性，AC₅₀ 值 < 43 µM (隨后被排除)。最終篩選出 994 種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的無(wú)毒性化合物，用于針對(duì)肝階段寄生蟲(chóng)的后續(xù)評(píng)估。

圖 5. 針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)無(wú)性血期寄生蟲(chóng)的定量高通量篩選^[3]。

   



   

對(duì)比測(cè)試結(jié)果表明：持續(xù) 3 h 的生物發(fā)光穩(wěn)定性的檢測(cè)中，MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的發(fā)光信號(hào)值比較穩(wěn)定 (圖 5a)；不同細(xì)胞數(shù)的線性范圍中，MCE 產(chǎn)品線性關(guān)系良好，與進(jìn)口 競(jìng)品線性幾乎一致 (圖 5b)；且對(duì)于不同細(xì)胞系，MCE 產(chǎn)品與進(jìn)口競(jìng)品檢測(cè)信號(hào)值相當(dāng) (圖 5c)。綜上檢測(cè)結(jié)果表明，MCE CTG 試劑盒可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、靈敏、批次間差異較小的不同細(xì)胞系的細(xì)胞活力檢測(cè)。

表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 產(chǎn)品特性

靠譜的細(xì)胞活力 CTG 檢測(cè)試劑，尊貴的 VIP 客戶體驗(yàn)，想發(fā) SCI 深夢(mèng)囈語(yǔ)的心。無(wú)需按捺您的“蠢蠢欲動(dòng)”，小 M 早已備好你想要的試用裝 (試用裝鏈接)。體驗(yàn)不收費(fèi)，時(shí)間最寶貴~ 快快申領(lǐng)吧！

實(shí)驗(yàn)小 Tips，附上 CTG 使用注意事項(xiàng)，希望你能早日發(fā) SCI 啦。

1. 熒光素酶的活性對(duì)溫度較為敏感，反復(fù)凍融會(huì)致其逐漸失活，建議分裝凍存，避免反復(fù)凍融。凍融時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致試劑中出現(xiàn)少量沉淀，可平衡至室溫后觀測(cè)沉淀溶解情況，如仍有殘留，可離心后去除。
2. 本產(chǎn)品在使用或分裝時(shí)所使用耗材應(yīng)注意避免 ATP 污染。
3. 若待測(cè)藥物的溶劑含量較高，熒光素酶反應(yīng)可能會(huì)被干擾，致化學(xué)發(fā)光信號(hào)受到影響，可設(shè)置含有溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液的對(duì)照孔以排除此干擾。
4. 檢測(cè)時(shí)需使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相鄰孔之間可能會(huì)產(chǎn)生相互干擾。如使用透明板，可使用不透明的白色膠帶粘貼孔底。
5. 建議在避光環(huán)境下進(jìn)行熒光檢測(cè)。
6. 由于整個(gè)發(fā)光反應(yīng)非常迅速，建議加入 CTG 試劑孵育 10 分鐘后，立即檢測(cè)熒光。

 

相關(guān)產(chǎn)品

Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8，簡(jiǎn)稱 CCK-8 試劑盒或 CCK8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速、高靈敏度試劑盒。

CTG Cell Viability Detection Reagent MCE CTG 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì) ATP 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。

Cytotoxicity LDH Assay Kit MCE LDH Assay Kit 是通過(guò)分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測(cè)定細(xì)胞損傷的試劑盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可獲得死細(xì)胞、活細(xì)胞數(shù)據(jù)。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
 

參考文獻(xiàn)

 
1. Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.   
 
2. Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587.
 
3. Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121. 

點(diǎn)擊化學(xué)：https://www.medchemexpress.cn/click-chemistry.html