來(lái)自Merck

 

溶瘤病毒（Oncolytic virus）療法是一種新型免疫療法，基于病毒在腫瘤中的感染和復(fù)制來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，并增強(qiáng)適應(yīng)性免疫。該療法通常使用的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒和柯薩奇病毒（Coxsackievirus）。

 

2022年，Merck發(fā)表兩篇文章利用全自動(dòng)毛細(xì)Digital Western技術(shù)定量表征柯薩奇病毒（Coxsackievirus A21 ，CVA21） VP1、VP2、VP3、VP4和VP0，并探究純化工藝對(duì)病毒顆粒影響。

 

 

柯薩奇病毒

CVA21是一種腸病毒，基因組為單鏈RNA（~7.4 kb），其衣殼是由60個(gè)蛋白亞基所組成的二十面體，直徑為30 nm。

CVA21示意圖片

 

CVA21絞殺癌癥細(xì)胞機(jī)制是通過(guò)與癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)受體（Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1），即細(xì)胞間黏附分子-1相結(jié)合，上調(diào)其表達(dá)。ICAM-1在控制腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起重要作用。CVA21的臨床研究顯示了其良好的安全性和靶向腫瘤細(xì)胞死亡的特性。

 

快速、準(zhǔn)確及可量化表征病毒載體空/完整/部分完整的衣殼對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)、工藝開(kāi)發(fā)、滿足監(jiān)管要求和驗(yàn)證生產(chǎn)過(guò)程至關(guān)重要。

 

 

鑒定表征

 

成熟病毒（Mature virion/Full particle）含有 VP1、VP2、VP3和VP4。未成熟病毒（Immature virion/Empty particle）僅含有VP0、VP1和VP3。

 

已組裝的CVA21衣殼由原體（Protomer）和五聚體（Pentamer）組成。原體由VP1、VP3和前體蛋白（Precursor protein）VP0組成。5個(gè)原體組成一個(gè)五聚體。12個(gè)五聚體可組裝成缺少RNA基因組的空殼顆粒（Procapsid/Immature virion），或者包含病毒RNA基因組前病毒體（Provirion），當(dāng)VP0分裂成為VP4和VP2后形成成熟病毒（Mature virion）。

 

VP1代表總顆粒含量；VP4代表完整衣殼病毒；VP0代表未成熟病毒/空衣殼。通過(guò)VP0和VP4，可表征空殼與完整衣殼的相對(duì)比率。通過(guò)VP0和VP1，可表征空殼與完整衣殼的絕對(duì)比率。

 

CVA21原料藥（DS）和藥物產(chǎn)品（DP）的生產(chǎn)涉及多個(gè)單元操作，需在整個(gè)過(guò)程中表征總顆粒濃度以及空顆粒與完整顆粒的比率。在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中，總顆粒濃度被用來(lái)量化細(xì)胞培養(yǎng)和下游純化過(guò)程中產(chǎn)生的病毒顆粒的質(zhì)量產(chǎn)量。只含有VP1、VP3和VP0（37.2 kDa）的非感染空殼顆粒被認(rèn)為是與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)，其中大部分必須被去除。因此，DS和DP須被純化為主要包含具有感染性的、成熟的、完整的顆粒，即由VP1、VP2、VP3和VP4組成，理論分子量（MW）分別為33.2 kDa、29.9 kDa、26.5 kDa和7.3 kDa。

 

文獻(xiàn)已有報(bào)道使用如下幾種方法表征非包膜病毒衣殼，如腺相關(guān)病毒（AAV）。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和高壓排阻色譜（HPSEC）已被用于測(cè)定總AAV顆粒。同樣，冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）、離子交換色譜（IEX）、分析型超速離心（AUC）、毛細(xì)管等電聚焦（cIEF）和質(zhì)譜（MS）也已被用于表征完整與空AAV顆粒。類(lèi)似的方法已被用于表征柯薩奇病毒A16。但是，定量表征CVA21蛋白和病毒顆粒的分析方法十分有限。研究人員曾使用高壓排阻色譜/多角度光散射/折射（HPSEC/MALS/RI）定量總病毒顆粒，使用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）表征空殼率。但是，這兩種方法不能在細(xì)胞培養(yǎng)收獲樣品和未純化的中間體中進(jìn)行，因?yàn)闀?huì)受到培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞碎片干擾。

 

 

Merck評(píng)價(jià)

自首次引入毛細(xì)管Western Blot技術(shù)（即全自動(dòng)毛細(xì)管Digital Western技術(shù)，也被稱(chēng)為Simple Western）及其在疫苗應(yīng)用中首次報(bào)道，該技術(shù)已成一種非常實(shí)用且重要的分析疫苗產(chǎn)品的工具，包括鑒定、濃度、酶動(dòng)力學(xué)、穩(wěn)定性和試劑篩選。

 

Merck研究人員指出，全自動(dòng)毛細(xì)管Digital Western技術(shù)（Simple Western）是寶貴的分析工具，該技術(shù)可提供及時(shí)信息幫助指導(dǎo)下游工藝決策和優(yōu)化。并且，該技術(shù)擁有更廣泛的溶瘤病毒應(yīng)用拓展，以及基因治療領(lǐng)域中AAV相關(guān)應(yīng)用。

 

 

結(jié)果展示

圖1：全自動(dòng)毛細(xì)Digital Western（Simple Western）表征CVA21 VP0、VP1、VP2、VP3和VP4；

 

圖2：全自動(dòng)毛細(xì)Digital Western（Simple Western）絕對(duì)定量VP0，即未成熟病毒/空衣殼；

 

圖3：不同純化步驟（Purification step, PS）后表征VP0和VP4；

 

Digital Western技術(shù)加速基因治療

一站式探索多個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性

全自動(dòng)毛細(xì)管Digital Western技術(shù)作為創(chuàng)新性毛細(xì)管電泳免疫學(xué)技術(shù)，此技術(shù)已被基因治療和核酸藥物領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者廣泛采用，如Ionis Pharmaceuticals、Sarepta、pfizer、Regenxbio、Arcturus、MeiraGTx、Editas medicine、CRISPR Therapeutics、Alnylam、Dicerna、Arrowhead、Moderna、BioNtech、杭州嘉因生物、石藥集團(tuán)等。

 

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參考文獻(xiàn)：

1. Andrew R. Swartz, et al. “Binding of Coxsackievirus A21 procapsids to immobilized glutathione depends on cell culture conditions during infection,” Virology, Volume 573, 2022.

2. Gillespie, Paul F et al. “Quantitation of Coxsackievirus A21 Viral Proteins in Mixtures of Empty and Full Capsids using Capillary Western.” Human gene therapy, 2022.

3. Chuan Xiao, et al. “The Crystal Structure of Coxsackievirus A21 and Its Interaction with ICAM-1,” Structure, Volume 13, Issue 7, 2005.