由細(xì)菌性病原體結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的結(jié)核病(TB)是一個主要的全球衛(wèi)生問題，每年造成150萬人死亡。當(dāng)病原體進(jìn)入肺部時，細(xì)菌和宿主間產(chǎn)生的相互作用會誘導(dǎo)組織重塑，產(chǎn)生慢性炎癥病變，即肉芽腫。肉芽腫是結(jié)核病的病理標(biāo)志，然而它們的功能和形成機(jī)制仍然知之甚少。

哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院免疫與傳染病學(xué)系Eric J. Rubin教授團(tuán)隊，以“Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomas is spatially organized”為題在線發(fā)表于Nature Medicine（IF 87.241）。該研究團(tuán)隊通過以空間蛋白質(zhì)組學(xué)、空間代謝組學(xué)為核心的空間多組學(xué)技術(shù)，揭示了在肉芽腫形成過程中，其炎癥信號的空間定位信息及結(jié)核病疾病發(fā)生機(jī)理，為結(jié)核病臨床研究提供了理論依據(jù)。

 研究材料

人結(jié)核肉芽腫組織、兔結(jié)核肉芽腫組織

 技術(shù)路線

步驟1：建立人類肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)空間解析圖；

步驟2：篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白；

步驟3：空間代謝組學(xué)檢測肉芽腫；

步驟4：探究肉芽腫病灶區(qū)促炎反應(yīng)；

步驟5：探究肉芽腫周圍活性組織的抗炎癥反應(yīng)。

 研究結(jié)果

1. 建立人類肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)空間解析圖

作者使用來自多個個體的肺樣本以及來自同一肺不同分化階段的肉芽腫，根據(jù)組織學(xué)將這些病變分為固體肉芽腫、干酪樣肉芽腫和空洞性肉芽腫，并通過空間蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。首先使用激光顯微切割技術(shù)（LCM）分別提取出實性肉芽腫活性組織，干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的活性組織，以及干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的壞死組織，然后采用Label free方法對這5種樣本的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共鑒定到4406個蛋白，并以此建立了人類肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)的空間解析圖。

圖1 空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析肉芽腫蛋白表達(dá)圖譜

2. 篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白

作者通過分析肉芽腫的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)肉芽腫內(nèi)部的變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于肉芽腫亞型之間的變異。PCA分析及聚類結(jié)果表明，無論肉芽腫切除的病變類型如何，其活性區(qū)域都聚集在一起，壞死區(qū)域同樣如此。接著作者對得到的差異蛋白進(jìn)行GO和 KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的功能蛋白主要參與炎癥和抗微生物過程。值得注意的是，參與產(chǎn)生促炎二十烷類的蛋白質(zhì)在壞死區(qū)域中也更豐富。此外，代謝花生四烯酸（AA）的蛋白質(zhì)，包括ALOX5, ALOX5AP和LTA4H，在壞死組織區(qū)域中顯著富集。這些結(jié)果表明AA的產(chǎn)物、結(jié)核感染期間炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)二十烷類可能發(fā)揮重要作用。

圖2 不同肉芽腫樣本中差異蛋白的分布情況

3. 空間代謝組學(xué)檢測肉芽腫AA

作者使用免疫組化（IHC）和共聚焦顯微鏡來定位多個參與含AA溶血磷脂生產(chǎn)的磷脂酶，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)在整個肉芽腫中彌漫性表達(dá)。雖然生物合成酶的存在表明它們的最終產(chǎn)物可能會積累，但酶的豐度和其產(chǎn)物可能并不相關(guān)。因此作者使用空間代謝組學(xué)技術(shù)直接測量AA的豐度，對人類活性、干酪性和空洞性肉芽腫中的AA和AA前體進(jìn)行了成像，發(fā)現(xiàn)它們的豐度模式與空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定的代謝AA的蛋白質(zhì)表達(dá)一致。結(jié)果表明，正常肺組織中很少檢測到AA，但整個肉芽腫中都有AA合成，且在壞死組織邊緣富集。此外，兔活性組織和壞死組織的空間代謝成像顯示了與人類肉芽腫相似的AA分布模式。

圖3 空間代謝組學(xué)檢測肉芽腫中AA豐度

4. 探究肉芽腫病灶區(qū)促炎反應(yīng)

研究表明AA可以進(jìn)入促炎或抗炎通路。白三烯A4水解酶(LTA4H)是代謝AA的蛋白質(zhì)，作為一種促炎二十烷類，其能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且與TNF-α的產(chǎn)生有關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，LTA4H在壞死組織區(qū)域顯著富集。IHC結(jié)果顯示，空洞肉芽腫病變組織和干酪肉芽腫病變組織邊緣有較多的LTA4H，而在實性肉芽腫中幾乎沒有LTA4H。此外，TNF-α在實體肉芽腫中含量相對較低，但在干酪性肉芽腫和空洞樣肉芽腫的壞死邊緣含量較高。值得注意的是，IHC的結(jié)果表明TNF-α與LTA4H具有相似的分布，共定位約為85.3%。同樣的結(jié)果在兔子的實性和干酪性病變樣本中得到了重現(xiàn)。這些結(jié)果說明空間LTA4H介導(dǎo)的促炎反應(yīng)與TNF-α的產(chǎn)生有關(guān)。

圖4 白三烯生物合成在壞死和直接毗鄰壞死組織的細(xì)胞層中富集
 

圖5 TNF-α和LTA4H在壞死組織及其邊緣更為豐富

5. 肉芽腫周圍活性組織的抗炎癥反應(yīng)研究

與壞死肉芽腫的中心相反，在肉芽腫周圍發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中含有更多的抗炎蛋白質(zhì)組學(xué)特征，即抗炎調(diào)節(jié)劑和還原劑在肉芽腫周圍富集。在二十烷類通路中，前列腺素合成可緩和結(jié)核病變中的炎癥。負(fù)責(zé)前列腺素合成的酶，即環(huán)氧化酶1和2 (COX1/2)，在實體肉芽腫中富集，與該肉芽腫整體炎癥較輕的特征一致。

通過LC-MS靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析前列腺素濃度，發(fā)現(xiàn)它們在活性組織中表達(dá)更豐富。在空洞性肉芽腫和干酪樣肉芽腫中，作者發(fā)現(xiàn)COX1和COX2在活性組織層中廣泛表達(dá)，但在壞死的干酪性區(qū)域中基本不表達(dá)，這與LTA4H豐度的模式形成對比。此外，雖然LTA4H在巨噬細(xì)胞亞群中特異性表達(dá)，但作者發(fā)現(xiàn)COX1/2在巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)。在兔組織中，相比于TNF-α和LTA4H，COX1/2在活性組織區(qū)域更豐富，而在壞死的干酪性區(qū)域中較少，這與在人類組織中的觀察結(jié)果相同。因此，各種二十烷類化合物(白三烯)的相對豐度表明，肉芽腫的高度促炎中心被緩和炎癥的分子包圍，包括COX1/2通路的一些前列腺素，可以緩解炎癥。

圖6 COX1/2在所有肉芽腫區(qū)域廣泛表達(dá)

 小結(jié)

該文章通過空間蛋白質(zhì)組學(xué)、空間代謝組學(xué)等研究方法，繪制了人類肉芽腫的空間分子圖譜。研究結(jié)果表明，肉芽腫中心具有以抗微生物、ROS和二十烷類特征的促炎環(huán)境。相反，肉芽腫周圍的活性組織具有相對抗炎的特征，且肉芽腫內(nèi)不同種類的區(qū)域之間有獨特的分子特征。盡管此結(jié)果需要在更大的樣本集中得到證實，但本文的研究數(shù)據(jù)表明，真正的平衡發(fā)生在局部，系統(tǒng)性干預(yù)可能相當(dāng)復(fù)雜。

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