人體每天都會產(chǎn)生上億個死亡細(xì)胞。將舊細(xì)胞清除，給新的細(xì)胞留出位置，才能夠使組織或器官保持活力與穩(wěn)態(tài)。如果清除過程不順利，則有可能會導(dǎo)致不良后果，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡誘因之一就是凋亡細(xì)胞的積累誘發(fā)細(xì)胞繼發(fā)性壞死，釋放與損傷相關(guān)的分子模式，導(dǎo)致大范圍的炎癥反應(yīng)。因此，清除死亡細(xì)胞對維持體內(nèi)平衡具有重要意義。

胞葬作用 (Efferocytosis) 就是指吞噬細(xì)胞清除程序性死亡細(xì)胞的過程。在大多數(shù)組織中，胞葬作用由專職性吞噬細(xì)胞 (巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞) 或垂死細(xì)胞附近的非專職性吞噬細(xì)胞 (上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞) 來完成。胞葬作用能夠阻止垂死細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死，以免釋放出可能引起炎癥的有害細(xì)胞內(nèi)容物 (如氧化物和蛋白酶)。那么吞噬細(xì)胞是如何識別垂死細(xì)胞并清除掉它們的呢？ 來聽聽胞葬作用的三部曲~Find-Eat-Digest~♪ 

 

• 垂死細(xì)胞躲貓貓？Find！

垂死細(xì)胞會釋放出可溶性介質(zhì)，這些介質(zhì)中就包含讓吞噬細(xì)胞識別的 “Find me” 信號，包括核苷酸 (如 ATP, UTP)、膜脂 (如磷酸鞘氨醇)、趨化因子 (如 CX3CL1) 等。這些信號不僅能吸引吞噬細(xì)胞，還能使吞噬細(xì)胞做好 “作戰(zhàn)” 的準(zhǔn)備，例如增強(qiáng)吞噬受體和消化機(jī)制的表達(dá)。

 

凋亡細(xì)胞的核苷酸 “Find me” 信號可通過 pannexin 通道 (被凋亡過程中 caspase 3/7的裂解激活) 釋放 (圖 1)。釋放的 ATP 通過嘌呤受體 P2Y 誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞遷移。此外，核苷酸還能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫機(jī)制。例如，凋亡細(xì)胞的 ATP 或 AMP 可轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷再通過腺苷受體抑制炎癥，上調(diào)抗炎 (anti-inflammatory) 和促消炎 (pro-resolution) 基因表達(dá) (包括 Nr4a1 和血小板反應(yīng)蛋白)。 非凋亡細(xì)胞的脂膜完整性被破壞，炎癥信號直接被釋放到細(xì)胞外。被病原體感染的細(xì)胞會釋放病原體相關(guān)分子模式 (PAMP)，該信號可與吞噬細(xì)胞上或吞噬細(xì)胞中的模式識別受體 (PRR) 結(jié)合，影響巨噬細(xì)胞的功能和免疫激活。另外，非凋亡細(xì)胞也會釋放損傷相關(guān)分子模式 (DAMP)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，可作為巨噬細(xì)胞的趨化因子。  

圖 1. 吞噬細(xì)胞識別凋亡細(xì)胞^[1]

凋亡細(xì)胞釋放 “Find me” 信號 (核苷酸、膜脂、趨化因子等)，吞噬細(xì)胞上相應(yīng)的受體與之結(jié)合，誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞遷移、上調(diào)抗炎/促消炎基因表達(dá)，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架 

• 找到美味大餐！Eat！

吞噬細(xì)胞遷移到凋亡細(xì)胞附近后，表面受體識別凋亡細(xì)胞的 “Eat me” 信號，與之結(jié)合。“Eat me” 信號包括磷脂酰絲氨酸 (Phosphatidylserine, PS)、鈣網(wǎng)蛋白、氧化低密度脂蛋白等，其中 PS 是最有效、進(jìn)化上最保守的信號分子。所有形式的細(xì)胞死亡的一個共同特征是質(zhì)膜中磷脂不對稱性的喪失，PS就會暴露在細(xì)胞外，促進(jìn)死亡細(xì)胞被吞噬。凋亡過程中，位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)的 PS 會在早期階段從內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到表面。吞噬細(xì)胞的 PS 受體可以直接或間接識別暴露在表面的 PS。BAI1 (PS 受體) 與 PS 結(jié)合后，通過 ELMO1-DOCK 復(fù)合物啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，以誘導(dǎo) Rac1 介導(dǎo)的肌動蛋白細(xì)胞骨架重排 (圖 2)，為 “吃掉” 凋亡細(xì)胞做好準(zhǔn)備。 
與之相對的是，健康細(xì)胞表面暴露 “Don't eat me” 信號，包括 CD47 和 CD24。活細(xì)胞上的 CD47 與巨噬細(xì)胞的 SIRPα 結(jié)合，導(dǎo)致 SIRPα 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸化，募集到的 SHP1/2 再通過非肌肉肌球蛋白 IIA 來抑制吞噬作用 (圖 2)。這些信號能使健康細(xì)胞避免被吞噬細(xì)胞清除。

 

圖 2. 吞噬細(xì)胞結(jié)合凋亡細(xì)胞^[1]

吞噬細(xì)胞直接 (BAI1, TIM1) 或間接 (AXL, MerTK) 識別凋亡細(xì)胞表面的 PS，激活 ELMO 和 DOC 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活 GTPase RAC1，增強(qiáng)肌動蛋白重塑和吞噬杯的形成。健康細(xì)胞表面的 CD47 能阻止被吞噬

  

• 吃太撐了？Digest！

 

• 垂死細(xì)胞的吞噬

在與垂死細(xì)胞結(jié)合后，吞噬細(xì)胞啟動肌動蛋白重塑，質(zhì)膜內(nèi)陷及局部外溢形成吞噬體，通過胞吞作用將垂死細(xì)胞 “吃掉”。胞吞后形成吞噬體，吞噬體膜會發(fā)生多種生化變化，這些過程由 Rab GTPase 蛋白家族控制。吞噬體成熟后，通過形成 Ca²⁺ 依賴性 SNARE 復(fù)合物 (由 VAMP7 和 Syntaxin 7 組成) 與溶酶體直接融合 (圖 3a)。溶酶體內(nèi)有大量蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，可消化吞噬體中凋亡細(xì)胞。另外還有 LC3 (微管相關(guān)蛋白 1A/1B-輕鏈 3) 相關(guān)吞噬作用 (LAP) 通路 (圖 3b)。吞噬細(xì)胞吞噬垂死細(xì)胞后，LAP PI3K 復(fù)合物被募集到含有凋亡細(xì)胞的LAP相關(guān)吞噬體 (LAPosome)，該復(fù)合物對 LAPosome 的保持至關(guān)重要，并且激活了 LC3 的連接機(jī)制。LC3 的連接促進(jìn)了 LAPosome 與溶酶體融合，提高了清除死細(xì)胞的效率并且保持免疫沉默。 

圖 3. 吞噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞^[2]

a. 溶酶體降解途徑：VPS34 被募集到RAB5-positive早期吞噬體，催化磷脂酰肌醇形成 PI3P (這些都是吞噬體成熟所必需的物質(zhì))，早期吞噬體成熟為晚期吞噬體后，最終與溶酶體融合。b. LAP 通路：LAP PI3K 復(fù)合物 (由 Beclin 1、VPS34、VPS15、UVRAG 和 Rubicon 組成) 激活 LC3 與 LAPosome 的連接，促進(jìn) LAPosome 的成熟，以及與溶酶體融合

• 垂死細(xì)胞的消化

溶酶體中含有大量蛋白酶、核酸酶、脂肪酶。吞噬體與溶酶體結(jié)合后，形成新的吞噬溶酶體 (Phagolysosome)。高酸度的環(huán)境 (pH=4.5~5.0) 和活性組織蛋白酶能降解垂死細(xì)胞。吞噬細(xì)胞還可重利用一些降解的垂死細(xì)胞成分。 

大部分情況下，死亡細(xì)胞的數(shù)量都是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過吞噬細(xì)胞，所以吞噬細(xì)胞需要同時清除多個細(xì)胞。而垂死細(xì)胞帶有膜、膽固醇、蛋白質(zhì)、核酸等，這些物質(zhì)需要被代謝。這對于吞噬細(xì)胞來說是巨大的負(fù)擔(dān)，需要控制其自身的體積和表面積以及迅速改變免疫代謝環(huán)境。凋亡細(xì)胞本身也能改變吞噬細(xì)胞的免疫代謝 (圖 4)：(1) 凋亡細(xì)胞表面的 PS 與受體結(jié)合后能激活或上調(diào) LXR 和 ABCA1，可促進(jìn)膽固醇的代謝與輸出；(2) 凋亡細(xì)胞線粒體的脂肪酸氧化可促進(jìn)抗炎因子 IL-10 的表達(dá)；(3) 吞噬細(xì)胞利用凋亡細(xì)胞的精氨酸 (Arginine) 驅(qū)動肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)之后幾輪的凋亡細(xì)胞攝�。�(4) 糖酵解與葡萄糖輸入的增加也促進(jìn) ATP 生成和肌動蛋白聚合。

   

圖 4. 凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞免疫代謝環(huán)境^[1]

 

常規(guī)的胞葬作用研究是在體外進(jìn)行，例如使用原代人巨噬細(xì)胞和凋亡 Jurkat T 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后，可在顯微鏡下觀察到胞葬作用的過程^[3]。但由于凋亡細(xì)胞易被清除，在體內(nèi)檢測仍是個巨大的挑戰(zhàn)。不過，辦法總比困難多嘛~

 

Raymond 等人開發(fā)了一種基因編碼的熒光報(bào)告基因 CharON，實(shí)現(xiàn)了在果蠅胚胎發(fā)育過程中胞葬作用的活細(xì)胞追蹤^[4]。這一研究結(jié)果于今年 3 月發(fā)表在 Science 雜志上。

 

研究者們首先設(shè)計(jì)了針對細(xì)胞凋亡和胞葬作用的傳感器。針對細(xì)胞凋亡，他們設(shè)計(jì)了 一種綠色熒光蛋白 (GFP) 探針。細(xì)胞凋亡時表達(dá)的 caspases 3/7 能切割 GFP，使之發(fā)出熒光 (圖 5a)；GFP 在溶酶體的酸性條件下易淬滅，經(jīng)突變 Q204H 基因后， GFP 對 pH 耐受。經(jīng)過以上改造，他們設(shè)計(jì)出 pH 耐受的綠色熒光探針 pH-CaspGFP——它能準(zhǔn)確地報(bào)告凋亡的細(xì)胞。針對吞噬作用，他們設(shè)計(jì)了一種新的紅色熒光 pH 值傳感器 pHlorina，它隨著 pH 值的降低而增加熒光強(qiáng)度。最后將這兩種傳感器結(jié)合起來，獲得探針 “CharON” (圖 5b)。CharON 轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，在凋亡時首先發(fā)綠色熒光，在被吞噬并在溶酶體內(nèi)酸化后，隨著 GFP 逐漸淬滅，pHlorina 的紅色熒光強(qiáng)度增加。CharON 將連續(xù)性細(xì)胞事件可視化。

 

為了追蹤體內(nèi)胞葬過程，研究者培育出 CharON 轉(zhuǎn)基因果蠅。在果蠅胚胎發(fā)育的中后期，發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 有一波細(xì)胞凋亡。CharON 使體內(nèi)胞葬過程更完整地呈現(xiàn)出來，包括細(xì)胞凋亡、吞噬細(xì)胞募集、Find、Eat 和 Digest (圖6)。通過 CharON 還觀察到，胚胎果蠅 CNS 中清除凋亡細(xì)胞的“重任”由具有吞噬功能的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和分散的腹側(cè)血細(xì)胞 (巨噬細(xì)胞) 共同承擔(dān)。并且還觀察到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中吞噬體的大小也有差異，巨噬細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的熒光更密集。 

 

圖 6. CharON 可視化果蠅胚胎內(nèi)胞葬作用的不同階段^[4]

0~1 min：凋亡細(xì)胞募集巨噬細(xì)胞；2 min：凋亡細(xì)胞與巨噬細(xì)胞結(jié)合；3~5 min：巨噬細(xì)胞吞噬。MΦ (藍(lán)色虛線輪廓)：GFP 標(biāo)記的巨噬細(xì)胞；A.C. (虛線輪廓)：凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo) pH-CaspGFP (綠色) 激活和巨噬細(xì)胞 (綠色) 遷移，靶標(biāo)與受體結(jié)合后被吞噬，消化后通過增加 pHlorina 信號 (紅色) 檢測凋亡細(xì)胞的酸化/降解 胞葬作用涉及多個信號通路，包括受體網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞溶質(zhì)信號分子、細(xì)胞骨架快速重排、凋亡細(xì)胞消化和免疫代謝通路。這些通路運(yùn)行不暢則有可能導(dǎo)致多種胞葬缺陷相關(guān)疾病 (神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜變性、動脈粥樣硬化、癌癥等)，因此了解胞葬作用機(jī)制對于治療這些疾病更有重要意義。盡管研究之路還很漫長，但相信總有一天我們能攻破難題~ 

相關(guān)產(chǎn)品

Annexin V-mCherry 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒  可方便、快捷的檢測細(xì)胞凋亡。經(jīng) Annexin V-mCherry 染色后，正常細(xì)胞基本無熒光，凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞呈紅色熒光。

細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒 采用 Hoechst 33342 和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）雙染的方法快速檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死。

DMUP 是一種有效的 CD47-SIRPα axis 抑制劑。DMUP 在 A549 細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 (apoptosis) 并增加巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

Neriifolin 可靶向 Beclin 1，抑制 LC3 相關(guān)吞噬體的形成，改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE) 的發(fā)展。

Pennogenin 3-O-beta-chacotrioside 是從七葉一枝花中分離得到的活性物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)自噬 (autophagy)，增加自噬相關(guān)蛋白 LC3 和 Beclin-1 的表達(dá)。

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參考文獻(xiàn)

1. Parul Mehrotra, Kodi S. Ravichandran. Drugging the efferocytosis process: concepts and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2022; 21(8): 601-620. 
2. Emilio Boada-Romero, et al. Mechanisms and physiology of the clearance of dead cells by efferocytosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Jul; 21(7): 398-414. 
3. Evans AL, Heit B, et al. Quantitative Efferocytosis Assays. Methods Mol Biol. 2017;1519:25-41. 
4. Raymond MH, Ravichandran KS, et al. Live cell tracking of macrophage efferocytosis during Drosophila embryo development in vivo. Science. 2022 Mar 11;375(6585):1182-1187.