今年 9 月，Neuron 發(fā)表了這樣一項有趣的研究：體外神經元在模擬游戲世界中能夠學習并表現(xiàn)出感知能力。在這項研究中，Kagan 和他的團隊開發(fā)了 DishBrain 系統(tǒng) (一種在結構化環(huán)境中能利用神經元固有的自適應計算能力的系統(tǒng))。
研究者們將 hiPSC 或 E15.5 小鼠胚胎的原代皮層細胞中提取的神經元電鍍到高密度多電極陣列 (HD-MEAs) 芯片上，并通過 DishBrain 系統(tǒng)嵌入到類似街機游戲的 “Pong” 中。DishBrain 系統(tǒng)可以從神經培養(yǎng)中 “讀取” 信息 (記錄神經元在培養(yǎng)中的電活動)，又能將感官數(shù)據(jù) “寫入” 到神經培養(yǎng)中 (即給神經元提供非侵入性的 “感覺” 電刺激)。并通過改變感官信息的模式，創(chuàng)造了不同的 “DishBrain” 環(huán)境，使神經元做出不同的響應 (類似于神經元網絡中活動產生的動作電位)。
 

圖 1. DishBrain 系統(tǒng)和實驗方案示意圖[1]

研究結果表明，在這個 DishBrain 系統(tǒng)，人類和小鼠的神經元在一個碟子里學會了玩電子游戲 “Pong” 。皮質神經元可以自我組織活動，在模擬游戲世界中顯示智力和有 “感覺” 的行為，并隨著時間的推移改變它們的行為。這項研究在擴展當前對大腦如何工作、智力如何產生的理解方面具有重要意義。

 

圖 2. DishBrain 中的神經細胞陣列正在工作[2]

不同顏色標志著不同類型的神經細胞及其組成成分。圖片來源:皮質實驗室

對于 “腦” 的研究，前進的腳步從未停止，上述研究讓 #首次證明人腦細胞在體外也有智力#、#人腦細胞在培養(yǎng)皿中打游戲# 等詞條一度火上微博熱搜。

就在前幾天，Nature 于 10 月 12 日在線發(fā)表的題為 Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids 的最新研究性文章，更是打開 “腦” 研究的新紀元。

   
 

• 關于 “人鼠融合腦”

在這里，首先復習下什么是類器官：由原代組織、ESCs 或 iPSCs 衍生而來的體外 3D 細胞簇，它們具有自我更新和自組織能力，并表現(xiàn)出與起源組織相似的器官功能 (可戳前文：類器官——從 2D 到 3D 的進階)。從多能干細胞生成層壓的大腦皮層樣結構，稱為人類皮質球體 (hCSs)。hCSs 包含來自深層和淺表皮質層的神經元，這些神經元在電生理上成熟，能表現(xiàn)出自發(fā)活動，被非反應性星形膠質細胞包圍并形成功能性突觸。皮質神經元參與神經網絡活動并產生復雜的突觸事件[3]。

hCSs 在培養(yǎng)皿中 (體外) 大概長下面這樣~

 

  
 
 

• 成功移植人類皮質球體 (hCS) 至鼠腦

這個研究中，作者團隊將類器官 “玩” 出了新花樣：首先將完整的體外 3D 人類皮層類器官 (human cortical organoids, hCO) 立體定向移植到出生后 3-7 天的早期無胸腺大鼠的 S1 區(qū) (初級體感皮層 S1 區(qū)，特異性投射系統(tǒng)的高級神經中樞；該區(qū)域可以接收來自鼠感覺器官的信號，然后將它們傳遞到大腦區(qū)域) (圖 4a)，整合為 t-hCO (transplanted hCO)。移植后約 2 個月，在 81% 的移植動物中鑒定到了 t-hCO (n=72)，并且有 87% 位于大腦皮層 (圖 4b)。核磁共振成像 (MRI) 結果表明，t-hCO 在 3 個月內體積增加了 9 倍 (圖 4d)，并且移植后 12 個月，移植動物的存活率也很高 (74%)。

小 M 偷偷感嘆：大制作啊，且不說技術牛轟轟，光是實驗造模的時間都體現(xiàn)出了對科研的熱愛~

 

a. 實驗設計原理圖。b. 移植2個月后 S1 區(qū) t-hCO 的 MRI 圖像。c. hiPS 細胞系移植成功率的量化。

d. 3 個月后的冠狀位 MRI 圖像。

 

• t-hCO 的細胞結構和細胞組成

 

移植成功的 t-hCO 的細胞組成具體是什么呢？體內生長的 t-hCO 又與體外的 t-hCO 有何不同？

免疫染色結果顯示 IBA1 的染色 (小膠質細胞) 充滿整個移植物，此外 t-hCO 中不僅存在大鼠小膠質細胞 (圖 5a)，還存在皮質祖細胞、神經元、神經膠質細胞以及少突膠質祖細胞。研究者們還確定了 t-hCO 中主要表達皮質細胞類別的簇，包括深層和表層谷氨酸能神經元、循環(huán)祖細胞等細胞 (圖 5b)。差異基因表達分析結果還發(fā)現(xiàn) t-hCO 神經元成熟相關的基因組的上調 (例如突觸信號傳導、樹突定位和電壓門控通道活性) (圖 5c)。

 

小知識：谷氨酸能神經元是一類能釋放興奮性遞質谷氨酸 (Glutamate) 到突觸間隙，產生興奮性突觸后電流的神經元。中樞神經系統(tǒng)中重要的興奮性神經元。

 

 

研究者們還發(fā)現(xiàn)，t-hCO 神經元相當大，總樹突長度比體外 hCO 增加六倍，樹突棘密度也顯著高于 hCO 神經元 (圖 6a-b)。此外，t-hCO 的谷氨酸能神經元簇與成人 L2/3、L5 和 L6 神經元亞類重疊，例如，與體外 hCO 神經元相比，靈長類動物特異性活性調節(jié)基因 (BDNF18、SCG2 和 OSTN) 在 t-hCO 神經元中的表達增加，這表明 t-hCO 具有人類皮層神經元高級形態(tài)和功能特征。
 
 

• t-hCO 適用于揭示人類疾病

既然 t-hCO 能夠重現(xiàn)人類皮層神經元高級形態(tài)和功能特征的能力，那么 t-hCO 是否可用于揭示疾病表型？
 
以蒂莫西綜合征 (Timothy Syndrome, TS) 為例，研究者們將 TS 患者和對照參與者的來源的 hCO，移植至大鼠 (圖 7a)，與對照相比，TS hCO 樹突形態(tài)發(fā)生了改變，具有異常的樹突分支模式 (圖 7b)，這種分支異常的模式，與作者團隊以前關于 TS 疾病的研究結果一致。而且這種異常的分支模式，在類似分化階段的體外 TS hCO 中沒有表現(xiàn)出來 (圖 7c)。由此可見，通過將人腦組織植入大鼠體內來揭示疾病表型，十分可行。
 

 

 

 

• t-hCO 在大鼠體內的成功融合

那么 t-hCO 細胞在多大程度上融入了大鼠 S1？以及 t-hCO 是否可以在活體環(huán)境下被感官刺激激活？
 
用改造的腺相關病毒 rabies-dG-GFP/AAV-G 感染 hCO，并移植到大鼠 S1 中。在移植后 7-14 天，可以在鼠腦觀察到同側 S1 和腹基底核神經元中密集的綠色熒光蛋白 (GFP) 表達 (圖 8b-c)。為了評估在 t-hCO 細胞中是否可以引起突觸反應，電流刺激大鼠 S1、內囊、白質、t-hCO 中附近的纖維，可誘發(fā) t-hCO 神經元中的短潛伏期興奮性突觸后電流事件 (excitatory postsynaptic current events, EPSCs)，且 AMPA 受體拮抗劑 NBQX 可將其阻斷 (圖 8f-g)。這表明 t-hCO 在解剖學上成功整合到大鼠大腦中，成為了它的一部分！ 

圖 8. 移植的 hCO 接收與感覺相關的輸入[4]

a. Rabies-tracing 實驗示意圖。b. t-hCO 和大鼠皮層之間的 GFP 和人 STEM121 表達。c. GFP 表達細胞的定量。d-e. t-hCO 中 Netrin G1+ 丘腦末端。f-g. 大鼠 S1 或者內囊電刺激后 t-hCO 神經元的電流痕跡。

• t-hCO 激活大鼠神經元以驅動大鼠尋求獎勵的行為

那么，t-hCO 是否可以在活體環(huán)境下被感官刺激激活？最最最驚險的部分來了！

 

為了研究了 t-hCO 是否可以激活大鼠的神經電路來驅動行為，研究者將表達 hChR2-EYFP 的 hCO 移植到 S1 中，將光纖植入 t-hCO 中進行光傳輸。然后，對大鼠進行改良的操作性條件反射范式訓練 (圖 9a)。將動物放入行為測試室并隨機交錯呈現(xiàn)藍色和紅色激光刺激。如果動物在藍光刺激期間舔舐，動物會獲得水獎勵，但如果它們在紅光刺激期間舔舐則不會。

 

在訓練的第一天，無論是藍光還是紅光刺激，動物的舔舐行為都沒有差異。然而，在第 15 天！大鼠學會了把藍光刺激和喝水聯(lián)系了起來。移植了表達 hChR2-EYFP 的 hCO 的動物在藍光刺激期間表現(xiàn)出更多的舔舐。移植了表達對照熒光團的 hCO 的對照動物中未觀察到這些舔行為的變化 (學習成功率：hChR2 89%，EYFP 0%，圖 9b-e)。這表明植入的人腦類器官已經真正參與了大鼠大腦的工作，t-hCO 細胞可以激活大鼠神經元以驅動尋求獎勵的行為。

 

圖 9. 移植的 hCO 在大鼠神經元上

建立功能性連接并調節(jié)行為[4]

a. 行為任務的示意圖。b. 實驗動物在訓練第 1/15 天的表現(xiàn) (紅藍光試驗累積舔舐次數(shù))。c-d. 移植 t-hCO 表達 hChR2-EYFP 熒光團的的行為表現(xiàn)。e. 偏好評分的演化。

   

這項研究建立了人腦類器官與實驗動物連接的新模型，與單純的體外培養(yǎng)或構造動物疾病模型相比相比，利用老鼠腦內環(huán)境培育的人類器官更能還原疾病環(huán)境、更貼合實際疾病的情況，這讓后續(xù)模擬實驗變得更準確，進而幫助人們研究與治療自閉癥等神經類疾病。

 

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EGF 表皮生長因子，能夠刺激表皮細胞增殖，可用于腦類器官培養(yǎng)。

FGF-2/bFGF 一種內皮細胞和成纖維細胞的有效有絲分裂原，有著廣泛的生物學功能，包括有絲分裂發(fā)生、細胞存活、轉移形成等，常用于類器官的培養(yǎng)。

BDNF 一種神經營養(yǎng)因子，能夠與 TrkB 受體結合，調節(jié)神經發(fā)育過程，包括神經元的存活，分化，及突觸可塑性。

Neurotrophin-3 在神經系統(tǒng)中廣泛表達。Neurotrophin-3 在不同病變模型中可減少細胞損傷，促進神經元再生。

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參考文獻

1. Brett J Kagan, Andy C Kitchen, Nhi T Tran, et al. In vitro neurons learn and exhibit sentience when embodied in a simulated game-world. Neuron. 2022 Sep 20; S0896-6273(22)00806-6.

2. Heidi Ledford. Neurons in a dish learn to play Pong — what’s next? Nature News. 12 October 2022.
3. Anca M Paşca,1,13 Steven A Sloan, Stephen J Smith, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 2015 Jul;12(7):671-8.
4. Omer Revah, Felicity Gore, Kevin W Kelley, et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 2022 Oct;610(7931):319-326.