卞薇潔

博士研究生

北京大學

來魯華課題組

細胞熱位移實驗（CETSA）作為一種檢測藥物靶向性的手段，其主要缺陷是靈敏度仍然還不夠高，傳統(tǒng)的Western blot通常需要較高濃度的藥物靶蛋白的熱穩(wěn)定性才會發(fā)生比較明顯的變化。并且傳統(tǒng)Western blot操作過程中受到跑膠，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，顯影等人工操作的影響，重復性會相對較差。且實驗過程較為繁瑣，費時費力，無法實現(xiàn)高通量的藥物篩選。

而全自動毛細管Digital Western作為一種創(chuàng)新的技術(shù)，可以直接定量檢測蛋白質(zhì)的含量變化；其重復性好，消除了傳統(tǒng)Western blot方法不可避免的差異；靈敏度高，可檢測pg級別的蛋白質(zhì)，因此蛋白含量的變化也比較容易被檢測到；高通量，其可以全自動方式3小時內(nèi)提供24個樣本的數(shù)據(jù)，將有助于化合物的高通量篩選。

晝夜節(jié)律即生物鐘對于維持我們的生理和代謝功能尤為重要，最近的研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的破壞與一些慢性疾病比如情緒障礙和代謝性疾病以及癌癥有關(guān)，因此靶向生物鐘網(wǎng)絡(luò)的小分子調(diào)節(jié)劑成為疾病治療的新策略。CRY1蛋白作為生物鐘網(wǎng)絡(luò)最主要的抑制子發(fā)揮作用，由于其晶體結(jié)構(gòu)已知也被用于藥物設(shè)計中，我們通過CAVITY程序?qū)�口袋分析發(fā)現(xiàn)一別構(gòu)口袋可藥性良好，但至今沒有靶向該口袋的小分子調(diào)節(jié)劑被發(fā)現(xiàn)。因此我們通過理性藥物設(shè)計的方法，以期望更高效的獲得新型的生物鐘小分子調(diào)節(jié)劑。

前期結(jié)果中通過計算機輔助的藥物設(shè)計，我們發(fā)現(xiàn)了一個潛在活性化合物X，并且通過SPR、MST等實驗驗證了化合物X與CRY1的體外靶向性。因為CRY1作為轉(zhuǎn)錄抑制子位于細胞內(nèi)，因此我們需要檢測藥物在細胞中與靶蛋白的相互作用。細胞熱位移實驗（CETSA）是2013年以Pär Nordlund為首的瑞典Karolinska研究所團隊研發(fā)的實驗技術(shù)，用于檢測藥物在細胞中的靶向性。該實驗原理是即隨溫度提高，蛋白會解折疊在細胞中迅速沉淀，通過監(jiān)測加熱后可溶性蛋白含量分析其熔解曲線可表征其熱穩(wěn)定性，而藥物分子與靶蛋白的結(jié)合會改變其熱穩(wěn)定性。因此我們使用全自動毛細管Digital Western（即Simple Western）定量蛋白質(zhì)表達分析系統(tǒng)進行細胞熱轉(zhuǎn)移實驗分析。

我們選用293T細胞系，外源轉(zhuǎn)染CRY1-Flag，12h后加入DMSO / 化合物X孵育3小時，裂解細胞，使用Wes（全自動毛細管Digital Western型號之一）定量分析靶蛋白在加藥處理后隨溫度的變化情況�？梢钥吹交�合物處理后相比于Control組，熱穩(wěn)定性得到了明顯的提升（圖1），說明化合物X在細胞內(nèi)確實可以靶向CRY1蛋白。

圖1. 化合物X可以增強CRY1熱穩(wěn)定性。全自動毛細管Digital Western檢測化合物X對CRY1熱變性溫度的影響（左）CETSA 熔解曲線（右）。

CETSA作為一種檢測藥物靶向性的手段，其主要缺陷是靈敏度仍然還不夠高，傳統(tǒng)的Western blot通常需要較高濃度的藥物靶蛋白的熱穩(wěn)定性才會發(fā)生比較明顯的變化。并且傳統(tǒng)Western blot操作過程中受到跑膠，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，顯影等人工操作的影響，重復性會相對較差。且實驗過程較為繁瑣，費時費力，無法實現(xiàn)高通量的藥物篩選。而全自動毛細管Digital Western作為一種創(chuàng)新的技術(shù)，可以直接定量檢測蛋白質(zhì)的含量變化；其重復性好，消除了傳統(tǒng)Western blot方法不可避免的差異；靈敏度高，可檢測pg級別的蛋白質(zhì)，因此蛋白含量的變化也比較容易被檢測到；高通量，其可以全自動方式3小時內(nèi)提供 24個樣本的數(shù)據(jù)，將有助于化合物的高通量篩選。

在該部分研究中，我們成功發(fā)現(xiàn)了一個新型的CRY1調(diào)節(jié)劑，可以增強生物鐘網(wǎng)絡(luò)的振蕩，并且我們通過各種分子生物學手段驗證了其靶向性。而靶向生物鐘網(wǎng)絡(luò)由于化合物毒副作用低、多效性等特點具有很大優(yōu)勢，可以用于到一些生物鐘破壞相關(guān)疾病的治療中。比如近些年研究發(fā)現(xiàn)生物鐘破壞與癌癥有十分密切的關(guān)系，因此生物鐘的小分子調(diào)節(jié)劑或許可以改善藥物治療效果并提高患者的生存率，生物鐘小分子調(diào)節(jié)劑的開發(fā)具有很大的應(yīng)用前景。

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