于曉潔

博士研究生

北京大學(xué)

鄧宏魁課題組

在本研究的初期，我們使用傳統(tǒng)Western Blot技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的檢測，但是由于我們研究的轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核且豐度不高，如果提取總蛋白就會(huì)大大削弱目標(biāo)蛋白的水平，而傳統(tǒng)WB往往對于蛋白的需求量較高，導(dǎo)致我們檢測不到樣本中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，浪費(fèi)了許多時(shí)間和金錢成本。后來，偶然間得知北京大學(xué)國家蛋白質(zhì)中心平臺(tái)有一臺(tái)ProteinSimple的全自動(dòng)Digital WB，可以實(shí)現(xiàn)微量蛋白的檢測，因此我們開始嘗試使用Wes來檢測我們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子。

Wang, Yuting et al. Unveiling E2F4, TEAD1 and AP-1 as regulatory transcription factors of the replicative senescence program by multi-omics analysis. Protein & Cell (IF: 14.87), 2022.

細(xì)胞衰老，影響多種生理和病理過程，對整個(gè)機(jī)體衰老尤為重要。目前研究領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子能夠影響衰老表征，但是仍缺乏通過多組學(xué)系統(tǒng)性分析傳代衰老過程的表觀變化。因此，本研究通過分析傳代衰老過程中細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、甲基化組以及染色體可及性的時(shí)序性變化過程，發(fā)現(xiàn)炎癥信號(hào)的上調(diào)以及增殖能力的下降是傳代衰老過程的主要特征。進(jìn)一步整合分析以及利用遺傳學(xué)手段，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F4、TEAD1和AP1是傳代衰老過程重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。過表達(dá)E2F4能夠提高衰老細(xì)胞的增殖潛力，改善細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改變衰老相關(guān)的甲基化位點(diǎn)。敲低TEA D1同樣能夠改善細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改變部分衰老的轉(zhuǎn)錄譜學(xué)特征。另外，敲低ATF3，作為AP1家族轉(zhuǎn)錄因子的核心成員，能夠降低衰老細(xì)胞cdkn2a(p16)的基因表達(dá)。綜上所述，本研究結(jié)果通過多組學(xué)分析確定了調(diào)控衰老程序的轉(zhuǎn)錄因子，為抗衰老提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

在本研究中，我們使用了ProteinSimple的全自動(dòng)Digital Western Blot（也稱Simple Western）進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。本研究中利用Wes（Digital WB型號(hào)之一）對過表達(dá)及敲低的基因進(jìn)行蛋白水平的檢測，由于轉(zhuǎn)錄因子是需要表達(dá)出蛋白發(fā)揮作用，因此通過遺傳學(xué)手段操控轉(zhuǎn)錄因子除了檢測mRNA水平，蛋白水平的檢測也是必不可少。通過Wes檢測，可以清楚的說明我們確實(shí)過表達(dá)及敲低了目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，從而驗(yàn)證了我們的假設(shè)。

在本研究的初期，我們使用傳統(tǒng)Western Blot技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的檢測，但是由于我們研究的轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核且豐度不高，如果提取總蛋白就會(huì)大大削弱目標(biāo)蛋白的水平，而傳統(tǒng)WB往往對于蛋白的需求量較高，導(dǎo)致我們檢測不到樣本中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，浪費(fèi)了許多時(shí)間和金錢成本。

后來我們也嘗試了分離提取核蛋白，但是可能是由于提取過程的損耗，得到的核蛋白量也很低，達(dá)不到傳統(tǒng)WB的需求量（10-15ug以上），因此在前期也是繞了很多彎路。后來，偶然間得知北京大學(xué)國家蛋白質(zhì)中心平臺(tái)有一臺(tái)ProteinSimple的全自動(dòng)Digital WB，可以實(shí)現(xiàn)微量蛋白的檢測，因此我們開始嘗試使用Wes來檢測我們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子。在技術(shù)支持的幫助下，我們在僅使用總蛋白（即無需提純核蛋白）的基礎(chǔ)上檢測到了目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，也清晰展現(xiàn)出了我們想要的結(jié)果，即過表達(dá)或者敲低目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的表達(dá)量升高或降低。在這里，也非常感謝北大國家蛋白質(zhì)中心平臺(tái)提供了ProteinSimple的Digital WB儀器，為我們解決了研究過程遇到的難題。

未來，我們還是期望致力于衰老及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前人口老齡化是全世界共同面對的問題，但是領(lǐng)域內(nèi)大家對于衰老的認(rèn)識(shí)還在積累中，因此從基礎(chǔ)研究到未來的臨床轉(zhuǎn)化還有一段很長的路要走。我們希望通過基礎(chǔ)研究積極為認(rèn)識(shí)衰老以及對抗衰老做出一些微薄之力，以期望早日實(shí)現(xiàn)全民健康衰老。

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