什么技術能被RNA藥物領域領導者廣泛采用？

如mRNA藥物領域Moderna、BioNtech和CureVac等；ASO領域中Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等；siRNA領域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等；saRNA領域MiNA Therapeutics和中美瑞康等，及其他RNA療法公司。

隨著mRNA新冠疫苗成功，RNA藥物進入了快速發(fā)展階段。在全球范圍內，RNA療法為各國研究人員擴大藥物開發(fā)靶點范圍提供了獨特機會，其作用靶點的多樣性引起了領先的科研機構、新興生物技術公司和大制藥公司極大關注。

 

目前有多不同類型RNA療法在研發(fā)過程中，主要包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、Aptamer（核酸適配體）等等。

 

作為一類新的藥物治療形態(tài)，可對常規(guī)藥物分子無法靶向的蛋白質和基因進行選擇性作用，RNA核酸藥物已經在多種疾病中應用。

 

 

盡管RNA療法研發(fā)取得了非凡的進步，還有很多問題和挑戰(zhàn)需要克服，如RNA高度不穩(wěn)定、體內遞送效率低、宿主細胞免疫原性等。RNA分子以藥物或靶向RNA小分子形式直接用于治療兩種模式。RNA藥物可利用內源性調節(jié)機制，并可特異性調節(jié)目標靶點。RNA藥物須通過細胞膜并具有結合細胞內靶標能力，并調控基因表達，進而實現(xiàn)相關蛋白質表達調節(jié)。

 

RNA療法基本原理

 

蛋白質表達水平檢測是藥理藥效研究非常重要的方面，目前有多種技術可以實現(xiàn)不同基質中分泌型和內源性蛋白質定量分析，例如ELISA技術，LC-MS技術、Western Blot技術等，也有一些創(chuàng)新性技術逐步被主流核酸藥物公司所采用，本文將介紹核酸藥物領導者采用什么技術解決研發(fā)中蛋白質分析問題。

 

 

案例1：Moderna--臨床前動物模型中蛋白質表達定量技術

Moderna公司目前在研臨床I期mRNA療法，mRNA-3927用于治療丙酸血癥（Propionic acidemia，PA）。

 

臨床前小鼠動物模型研究表明，雙RNA療法可恢復代謝功能。丙酸血癥是一種線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代謝紊亂，PCC由六個α(PCCA)和六個β(PCCB)亞基組成。采用編碼人類PCCA和PCCB的雙mRNA組合，裝載在可生物降解脂質納米顆粒（LNP）中，在肝臟中可產生功能性PCC酶。

 

雙mRNA編碼的蛋白質比單獨mRNA具有更高PCC酶活性。下圖a-c是比較雙RNA共轉染與hPCCA或hPCCB mRNA單獨轉染數(shù)據(jù)。a和d圖是酶活性評估，b和c圖是采用毛細管Digital Western定量檢測患者成纖維細胞中PCCA和PCCB蛋白質表達。

 

 

案例2：Arcturus Therapeutics--組織中定量檢測hOTC表達

Arcturus Therapeutics公司臨床階段mRNA療法ARCT-810用于治療鳥氨酸氨甲�；�轉移酶缺乏癥 (Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTCD)。該疾病是尿素循環(huán)障礙中最常見的一種遺傳性代謝病，OTC基因突變會導致高氨血癥發(fā)作。

 

脂質納米顆粒（LNP）裝載的OTC mRNA（LUNAR-OTC mRNA）利用專有的脂質藥物介導技術，可安全高效地將OTC mRNA遞送到肝細胞內，使患者自身肝細胞內能自然產生功能正常的OCT酶。進而，臨床前小鼠模型研究中，通過測量OTC-mRNA藥物處理后小鼠肝臟和血漿中OTC酶活性和蛋白質表達，來反映LUNAR-OTC mRNA藥物在小鼠模型中藥效。

 

人鳥氨酸轉氨甲酰酶 (hOTC) 在小鼠肝臟中蛋白表達。使用全自動毛細管Digital Western（Jess, Simple Western）系統(tǒng)定量檢測小鼠肝臟中hOTC 蛋白表達，以重組蛋白為校正曲線來進行定量。使用抗人OTC抗體，從四個遞增劑量組觀察到明顯的劑量反應，在未治療OTC缺陷組或未治療野生型組中未檢測到hOTC蛋白。OTC蛋白表達水平與肝臟樣本中OTC活性有很好的相關性。

 

 

案例3：Ionis Pharmaceuticals--ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能

射血分數(shù)（測量每次心臟收縮時離開心臟的血液百分比）保留的心力衰竭（HFpEF）是普遍和致命的。目前為止，沒有很好的靶向治療藥物。病因之一是心室充盈受損，德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學中心和Ionis Pharmaceuticals科學家使用靶向心臟剪接因子RBM20的反義寡核苷酸（ASO）可改善其功能。

 

在比剛度增加的成年小鼠中，2個月內每周給ASO可增加順應性肌動蛋白異構體表達，并改善心臟功能。人類工程心臟組織中驗證結果顯示，在ASO治療3周內RBM20表達下調至不到50%，導致沒有心臟病理狀況下適應性松弛動力學。本研究表明，抗RBM20 ASO可作為強大的心臟剪接調節(jié)劑，治療人類HFpEF。

 

注射RBM20 ASO有效抑制小鼠心臟RBM20表達。(B)圖是小鼠體內實驗設計，(C)用PBS或ASO處理的野生型(WT)和N2B敲除 (KO) 小鼠心臟組織中的Rbm20 mRNA表達，（D和E）采用全自動毛細管Digital Western檢測相應的RBM20蛋白表達豐度。mRNA和蛋白表達分子水平上，RBM20表達豐度下調50%以上。

 

全自動毛細管Digital Western技術是核酸藥物研發(fā)中蛋白質表達定量先進工具

以上Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals三個案例是Digital Western代表案例，此技術已經廣泛被RNA藥物領域領導者采用。如mRNA藥物領域的Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO方面Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA領域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA領域MiNA Therapeutics和中美瑞康等采用，及其他RNA療法公司。

 

全自動毛細管Digital Western技術作為創(chuàng)新性毛細管電泳免疫學技術，將Western Blot技術和ELISA技術合二為一，可利用微量組織樣本實現(xiàn)內源性蛋白質精準的相對定量和絕對定量。作為創(chuàng)新型生物分析方法，其具備傳統(tǒng)Western Blot蛋白質分子量可視化優(yōu)勢，定性更準確，同時具備ELISA和MS技術精準定量性能，其靈敏度和精密度符合高標準生物分析要求。

 

針對RNA療法應用的技術優(yōu)勢

1) Digital Western技術適合RNA療法體外和體內各種模型中靶蛋白表達定量分析，用于細胞系、類器官模型、小鼠動物模型和非人靈長類動物模型的關鍵蛋白質分析;

 

2) Digital Western技術樣本量需求是傳統(tǒng)Western Blot幾十分之一，只需要3μL樣本就可實現(xiàn)多重蛋白質表達檢測，特別適合微量珍貴樣本蛋白質分析;

 

3) Digital Western精準定量檢測，傳統(tǒng)Western Blot只能滿足樣本半定量需求，重復性比較差。RNA療法某些靶蛋白表達與臨床治療效果相關聯(lián)，可作為替代生物標志物，建立量效關系。要求靶蛋白分析檢測標準需要提高，要求技術需要經過嚴格驗證，Digital Western可滿足這些需求;

 

4) 符合RNA療法對自動化標準化和效率的需求，面對行業(yè)激烈競爭，需要提升研發(fā)效率。Digital Western實現(xiàn)了全自動化和標準化，軟件符合FDA 21 CFR Part 11合規(guī)性需求。系統(tǒng)3個小時完成一批次蛋白質分析，比傳統(tǒng)Western Blot和ELISA更快，大大提高了實驗效率，同時減少人力成本。

 

Jess全自動數(shù)字化蛋白質表達定量分析系統(tǒng) (Digital Western) 是Bio-Techne集團旗下蛋白質分析品牌ProteinSimple所有。系統(tǒng)利用毛細管電泳免疫學分析技術，可從微量樣品中自動吸取、分離、捕獲蛋白質，并通過化學發(fā)光或熒光檢測目的蛋白含量。Digital WB自動化程度高，重復性好，靈敏度高和具有較寬動態(tài)檢測范圍，這些特點滿足基因治療項目不同階段的目的蛋白定量需求。

 

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