熒光定量PCR基礎(chǔ)知識小課堂（一）
01 常規(guī)PCR和熒光定量PCR的區(qū)別是什么呢？
聚合酶鏈式反應(PCR)：一種對特定的靶核酸片段在體外進行快速擴增的方法。通常由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構(gòu)成，通過不同溫度的循環(huán)實現(xiàn)靶核酸的擴增。
實時熒光定量PCR (Real-time qPCR) 是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸/基因檢測技術(shù)，是一種在PCR反應體系中加入熒光標記探針或熒光染料，通過采集熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及強弱的變化，搭配軟件分析Ct值和標準曲線，對目的基因進行定性或定量分析的方法。
02 熒光定量PCR反應體系的組成都有什么呢？
熒光定量PCR反應體系包括：核酸模板、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、四種dNTP、熒光染料或Taqman探針以及含有Mg2+ 等的緩沖液。一般配置20μL或50μL體積的反應體系。
核酸模板
通常配置20 μL反應體系時，模板的使用量小于100 ng，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板時，模板量不超過體系終體積的20%。模板進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，常用于基因表達的檢測，在材料收集過程中，樣本需要立刻液氮速凍，并迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，盡量避免RNA的降解。一般將實驗材料分為對照組和處理組，組內(nèi)要有3組以上重復，以便后續(xù)對偏差較大的數(shù)據(jù)進行處理。
DNA聚合酶
在進行熒光定量PCR實驗時，需要選擇合適的耐熱聚合酶，具體需參考酶的特異性、保真性、耐熱性、擴增速率等多個指標。目前市面上較常用的是Taq DNA聚合酶，其他還有Vent系列、KOD系列、Pfu系列等多種類型的DNA聚合酶。
引物
是指人工合成的兩段寡核苷酸序列，其中一個引物與對應的DNA模板鏈目標區(qū)域3’端的堿基互補，另一個引物與另一條DNA模板鏈目標區(qū)域5’端的堿基互補。
脫氧核苷三磷酸（dNTP）
dNTPs是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的統(tǒng)稱。dNTPs作為DNA復制原料，它直接影響擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量、特異性以及保真性，因此在實驗過程中需要選擇濃度準確、純度高的試劑。
緩沖液
緩沖液的作用是為DNA聚合酶活性提供適宜的化學環(huán)境。通常緩沖液的pH為8.0-9.5，改變pH會影響核酸擴增量。另外緩沖液的關(guān)鍵組分Mg2+是酶工作所必需的離子，與 dNTPs 和模板螯合在一起，成為 DNA 聚合酶識別的底物。目前市面上的常用的緩沖液一般是2×的濃縮液，按照說明書的添加量配置即可。
熒光團基
熒光化學物質(zhì)可分為：熒光染料和熒光探針。
熒光染料以SYBR Green為代表，與DNA小溝區(qū)域非特異性結(jié)合，每形成一條雙鏈，就有染料與雙鏈DNA結(jié)合。通過光源激發(fā)染料產(chǎn)生熒光信號，熒光信號強弱與DNA雙鏈數(shù)量成正比。
熒光探針的發(fā)光機制與染料不同，利用的是一對能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團，即5′端的報告基團和3′端的淬滅基團。探針完整時，報告基團的熒光信號被淬滅基團所淬滅，擴增時，5'端外切酶活性將探針水解切割，報告基團和淬滅基團分離，熒光信號開始積累。
總的來說，熒光定量PCR作為核酸定量常用的檢測方法，體系配置簡單，適用范圍廣泛。在進行qPCR實驗時，不管是選擇熒光染料還是熒光探針，檢測方法都很有效，可以根據(jù)本身材料情況，選擇適合的方法。
Esan-Gene 162/164
