SmartBatch⁺主動(dòng)式組織透明化及染色一體機(jī)是基于Lifecanvas公司最新研發(fā)的Clear+透明化系統(tǒng)迭代設(shè)計(jì)而成，高度融合原有一代主動(dòng)式組織透明化SmartClear系統(tǒng)和主動(dòng)式免疫標(biāo)記SmartLabel系統(tǒng)所有功能，是一臺(tái)功能高度集約、高通量的快速主動(dòng)式透明化染色一體化設(shè)備。

用SHIELD方法透明化及染色的具體流程：（其它方法也有用到SmartBatch⁺一體機(jī)的，例如cubic透明化后，用其染色。此處用SHIELD方法為例來(lái)闡述SmartBatch⁺一體機(jī)的使用方法）

一. SHIELD固定

制備樣本，以下操作都注意遮光，可用錫箔紙包裹

2.  4°C下振蕩孵育。（小鼠腦20mL孵育3天，大鼠腦50mL孵育6天）

3.  將SHIEID ON Buffer預(yù)熱至 37°C振蕩孵育24h（小鼠腦20mL，大鼠腦40mL），

二. Smart Batch⁺進(jìn)行脫脂

1. “Delipidation Buffer（脫脂緩沖液）” 45°C”  24 小時(shí)（小鼠腦20mL，大鼠腦40mL）.

2. 一整瓶“Conduction Buffer”倒入樣本倉(cāng)。35mL “Delipidation Buffer” 加入樣本杯。

3. 樣本上機(jī)

4. 打開“Auxiliary Power（輔助電源）”，

5. 打開“Electrophoresis Power（電泳電源）”。

6. 按“Preset（預(yù)設(shè)）”直到顯示“Clearing Mode（透明化模式）”。

7. 每 2-3 天更新“Delipidation Buffer（脫脂緩沖液）”。

8. 完全脫脂后，樣本下機(jī) ，PBS洗（將樣本放在打光的底透臺(tái)上，沒有實(shí)心則透明化完成）

9. 清洗儀器

10.（不染色的話50% EasyIndex 24h，37°C ；100% EasyIndex 24h,37°C包膠成像）染色則不進(jìn)行此步驟

三.Smart Batch⁺進(jìn)行免疫標(biāo)記

實(shí)驗(yàn)：Day0 預(yù)孵育:

室溫“Primary Sample Buffer過(guò)夜。

實(shí)驗(yàn)：Day1 一抗標(biāo)記：

1. 樣本上機(jī)。

2. 一整瓶“Primary Device Buffer”倒入樣本倉(cāng)。

“Primary Sample Buffer” 倒入樣本杯，

3. 按照要求添加抗體、血清。

4. 將“Timer（定時(shí)器）”設(shè)為 18 小時(shí)。

5. 打開“Auxiliary Power（輔助電源）、“Electrophoresis Power（電泳電源）”和“Timed Shutdown（定時(shí)關(guān)機(jī)）”。

6. 按“Preset（預(yù)設(shè)）”，直到它顯示“Labeling 1 （一抗標(biāo)記）”

實(shí)驗(yàn)：Day2一抗洗滌和固定：

1. PH<8,下機(jī)（不小于8則延長(zhǎng)下機(jī)時(shí)間）

2. PBS洗8h,每?jī)蓚�(gè)小時(shí)更換一次PBS。

3. 4%PFA室溫振蕩過(guò)夜

實(shí)驗(yàn)：Day3 PFA洗滌及二抗順序標(biāo)記

1.      被動(dòng)洗滌6-8h，中間更換一次溶液，37°C

2.  按照要求添加二抗，Time設(shè)定為12h 。 

3． 打開“Auxiliary Power（輔助電源），“Electrophoresis Power（電泳電源）”，打開“Timed Shutdown（定時(shí)關(guān)機(jī)）”,“Preset（預(yù)設(shè)）”，直到它顯示“Labeling 2。

實(shí)驗(yàn)：Day4 二抗洗滌及PFA固定

二抗洗滌

1．“Secondary Sample Buffer（SS#緩沖液）”裝滿樣本杯

2. 將“Timer（定時(shí)器）”更改為 6 h,中間更換一次溶液。

3. 打開“Auxiliary Power（輔助電源），“Electrophoresis Power（電泳電源）”，打開“Timed Shutdown（定時(shí)關(guān)機(jī)）”。

4. 清洗設(shè)備，將樣本放入PBS中室溫振蕩

PFA固定

1. PBS洗。4% PFA固定二抗 室溫振蕩過(guò)夜。

2. PBS 洗，更換一次溶液。

3. 您已經(jīng)完成染色了！現(xiàn)在可以準(zhǔn)備開始進(jìn)行 折射率匹配 。
 

四.折射率匹配實(shí)現(xiàn)樣本光學(xué)透明

本實(shí)驗(yàn)方案需要使用 RI = 1.52 版本的 EasyIndex 。

1. 使用前最好將EasyIndex 過(guò)濾，消除里面的雜質(zhì)。

2. 50% EasyIndex + 50% 蒸餾水中， 室溫或37°C 下振蕩孵育，過(guò)夜

3. 100% EasyIndex， 室溫或37°C 下振蕩孵育，過(guò)夜。

如果始終無(wú)法透明，則沒有完全脫脂，只需將 EasyIndex 清洗掉并進(jìn)一步透明化即可。
 

五.包膠

六.LS18 Plus快速高分辨光片顯微成像

七. 專業(yè)的三維圖像處理及分析

 

SmartBatch⁺ 主動(dòng)式組織透明化及染色一體機(jī)主要是在SHIELD固定后的脫脂和染色的步驟中應(yīng)用，脫脂和染色極其重要，因此我們要嚴(yán)格按照步驟，小心操作。按照步驟中的要求，掌握好相應(yīng)的試劑，溫度以及時(shí)間，其中SmartBatch+簡(jiǎn)單快捷的操作，大大減少了使用者的工作量。

SmartBatch⁺不僅操作方便，而且容量大，可以12個(gè)小腦一起上機(jī)，適合批量處理，效果明顯優(yōu)于不上機(jī)處理的樣本�？梢宰詣�(dòng)定時(shí)關(guān)閉，不用嚴(yán)格按照時(shí)間進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，使用者可以更加便捷的開展實(shí)驗(yàn)。

SHIELD固定，透明化及染色的實(shí)驗(yàn)流程

日期	時(shí)間	步驟
星期五	上午9:00	SHIELD-Off
星期一	上午9:00	SHIELD-On
星期二	上午9:00	脫脂液（Delipidation Buffer）孵育
星期三	上午9:00	在SmartBatch+中進(jìn)行透明化
星期四	上午9:00	PBSN洗滌
星期五	下午5:00	一抗緩沖液孵�。≒rimary Sample buffer）孵育
星期一	上午9:00	更換一抗緩沖液孵育（Primary Sample buffer）
	下午3:00	開始一抗染色
星期二	上午9:00	檢查PH值（繼續(xù)電泳或者PBSN洗滌）
	下午1:00	更換PBSN
	下午5:00	PFA固定
星期三	上午9:00	用二抗緩沖液洗滌
	下午1:00	更換二抗緩沖液
	下午5:00	二抗
星期四	上午9:00	二抗染色后洗滌
	上午11:00	更換緩沖液，繼續(xù)洗滌
	下午1:00	PBSN洗滌

 

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