當(dāng)使用與樣本種屬來源一致的一抗時(shí)，會(huì)發(fā)生非特異性背景染色。如免疫組化實(shí)驗(yàn)中一抗和樣本的種屬來源都是小鼠(M.O.M. staining)就是這個(gè)問題的一個(gè)常見例子。這篇文章為大家解答如何在這類實(shí)驗(yàn)中防止非特異性背景信號(hào)的產(chǎn)生。

非特異性背景產(chǎn)生的原因
當(dāng)使用與樣本種屬來源一致的一抗進(jìn)行免疫染色實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，組織中的內(nèi)源性免疫球蛋白會(huì)被二抗識(shí)別，而二抗無法區(qū)分一抗和同種內(nèi)源性免疫球蛋白。因此會(huì)產(chǎn)生非特異性染色，并可掩蓋來自一抗的正確信號(hào)。

解決辦法
單價(jià)Fab片段可用于“屏蔽”或阻斷內(nèi)源性Ig表位，使其無法被標(biāo)記的二抗檢測。Fab片段只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此它們不會(huì)捕獲后續(xù)步驟中使用的主抗體。相反，整個(gè)分子IgG和F(ab’)2片段是二價(jià)的(它們有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))，對(duì)阻斷內(nèi)源性Ig無效。在與內(nèi)源性Ig結(jié)合后，二價(jià)抗體可能有一個(gè)開放的結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)捕獲在后續(xù)步驟重引入的一抗。

圖1. 抗體分子的分解(大約MW = 160 kDa)會(huì)產(chǎn)生許多不同的片段。木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段，每個(gè)約50 kDa。胃蛋白酶消化降解Fc結(jié)構(gòu)域，留下一個(gè)二價(jià)F(ab’)2片段，分子量約為110 kDa。

選擇與標(biāo)記的二抗同宿主的Fab片段，如Fab fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，阻斷與標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG相結(jié)合。物種來源保持一致以確保Fab片段和標(biāo)記的二抗之間沒有反應(yīng)。此外，在同一物種中培養(yǎng)的Fab片段將識(shí)別并因此阻斷標(biāo)記的次生分子識(shí)別的相同表位。不同的宿主動(dòng)物可能會(huì)識(shí)別內(nèi)源性Ig上不同的表位，阻斷可能是不完全的。

更多相關(guān)Fab片段二抗產(chǎn)品：

阻斷細(xì)胞或組織切片上的內(nèi)源性免疫球蛋白
·   將與一抗孵育后的樣本用5%的來自相同種類的正常血清進(jìn)行阻斷。
·   繼續(xù)用與樣本種屬來源相同的無偶聯(lián)的Fab片段二抗(20-40μg/ml)進(jìn)行孵育
·   接下來的步驟按照常規(guī)使用的protocol進(jìn)行

陰性對(duì)照:通過去除實(shí)驗(yàn)中的一抗，與標(biāo)記的二抗孵育，可確認(rèn)阻斷劑的阻斷效率。確認(rèn)內(nèi)源性信號(hào)確實(shí)被阻斷劑抑制后，繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)樣本的內(nèi)源性IgG處于高水平時(shí)，可能需要將Fab抗體的濃度增加到100µg/ml。為了避免Fab抗體被標(biāo)記的二抗取代，如果不影響目標(biāo)蛋白的抗原性，可能需要用戊二醛進(jìn)行輕微的后固定。

在Western blotting或ELISA應(yīng)用中，F(xiàn)ab抗體對(duì)阻斷免疫球蛋白并不有效。

Min X：指經(jīng)過吸附處理的二抗，可以最大程度的減少物種之間的交叉反應(yīng)

♱在考慮使用經(jīng)過吸附處理的抗體時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)檫@些抗體大大降低了表位識(shí)別能力，可能對(duì)一些單克隆抗體的識(shí)別能力較差。

*Anti-Hamster IgG (H+L) (min X Bov, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)可能不能識(shí)別所有亞美尼亞倉鼠單克隆抗體，因?yàn)樗�已�?jīng)過近親物種的吸附處理(粗體部分)。因此，最好使用對(duì)較少種類吸附的抗體，如抗亞美尼亞倉鼠IgG (H+L) (min X Bov Sr Prot)，除非在需要在小鼠和/或大鼠免疫球蛋白存在的情況下檢測亞美尼亞倉鼠單克隆抗體。