隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷發(fā)展，人們正在研究更大的生物隊(duì)列，通常使用從生物樣本庫或其他來源難以獲得的珍貴樣本進(jìn)行研究。這對工作流程提出了 2 個(gè)要求：更快的獲取酶解樣品的定量數(shù)據(jù)和使用更少量的樣品。數(shù)據(jù)非依賴型采集 (DIA) 作為對蛋白質(zhì)組樣本中大量蛋白質(zhì)進(jìn)行可重復(fù)定量分析的優(yōu)選工作流程，在這類研究中被廣泛應(yīng)用。

本研究優(yōu)化和評估了微升液相與 Zeno SWATH DIA 組合的使用，并與傳統(tǒng)SWATH DIA 進(jìn)行比較。同時(shí)測試比較了四種不同的梯度長度（5、10、20 和 45 分鐘）的鑒定結(jié)果，以滿足一系列應(yīng)用需求。

■  樣品準(zhǔn)備：人 K562 細(xì)胞裂解產(chǎn)物，來自SWATH acquisition performance kit (SCIEX)。進(jìn)樣量范圍為 12.5ng - 400 ng。

■  液相方法： ACQUITY UPLC M--Class液相系統(tǒng)（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，梯度：5min, 10min, 20min, 45min（表 1）。
 
表1.液相梯度洗脫參數(shù)


■  質(zhì)譜方法：ZenoTOF 7600系統(tǒng)2臺，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口采集，針對每個(gè)梯度長度優(yōu)化使用40、60 或 80 個(gè)窗口和 MS/MS 累積時(shí)間（表 2）。在MS/MS 模式，分別開啟Zeno trap（Zeno SWATH DIA 模式）和關(guān)閉 Zeno trap（SWATH DIA模式）參數(shù)下，樣品平行采集三次。

表2. 優(yōu)化的Zeno SWATH DIA方法參數(shù)


■ 數(shù)據(jù)處理：Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA-NN[1]軟件處理，使用數(shù)據(jù)庫流程，數(shù)據(jù)庫為之前由OneOmics™軟件包中ProteinPilot™軟件搜庫構(gòu)建的樣本譜圖庫。
 
 
1. Zeno SWATH DIA在低樣品量時(shí)的增益倍數(shù)評估

Zeno SWATH DIA和SWATH DIA 的進(jìn)樣量曲線由DIA-NN 軟件處理得到，以確定可重復(fù)定量分析的蛋白質(zhì)和肽段的數(shù)量。圖 1 顯示在 2 套 ZenoTOF™ 7600 系統(tǒng)上， 45 min液相梯度，每個(gè)進(jìn)樣量在 SWATH DIA 和 Zeno SWATH DIA 模式得到的數(shù)據(jù)。正如預(yù)期，Zeno SWATH DIA模式下，隨著進(jìn)樣量的增加，可定量蛋白質(zhì)數(shù)量隨之增加。K562 400 ng 進(jìn)樣量 ，在45 min液相梯度下，平均鑒定蛋白質(zhì)約 6200 個(gè)，其中可定量蛋白質(zhì)約 5,600 個(gè)（CV < 20%）。
 
 
當(dāng)固定進(jìn)樣量時(shí)，相比于 SWATH DIA，Zeno SWATH DIA可定量的蛋白質(zhì)和肽段數(shù)量大幅增加。在低進(jìn)樣量條件下，蛋白質(zhì)和肽段鑒定水平提升更高（圖 2）。
 
2. 快速液相梯度結(jié)果評估

通過測試 4 個(gè) 液相梯度長度。繪制進(jìn)樣量曲線以評估不同的液相梯度對定量蛋白質(zhì)數(shù)量的影響并確定實(shí)驗(yàn)的最佳進(jìn)樣量（圖 3）。結(jié)果表明，對于5 min和 10 min較短的液相梯度，最佳進(jìn)樣量約 100 ng 。對于20 min和 45 min較長的梯度，最佳進(jìn)樣量約200-400 ng。
隨著微升梯度時(shí)間的縮短，鑒定和定量的蛋白質(zhì)數(shù)量減少。但在相同進(jìn)樣量下， 20 min梯度定量的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎與45 min梯度一樣多。結(jié)果表明，20 min長度梯度是采集參數(shù)的最佳色譜方案（300 μm ID 分析色譜柱，5 μL/min），因其實(shí)現(xiàn)了峰形與肽段分離之間的平衡。對于樣本為少量的細(xì)胞酶解產(chǎn)物，首選分析較快的梯度，在進(jìn)樣量為 12.5 ng - 50 ng時(shí)，10 min梯度可獲得合適的蛋白質(zhì)覆蓋率和良好的樣品通量。

使用 20 min液相梯度的 Zeno SWATH DIA 數(shù)據(jù)，通過繪制蛋白質(zhì)定量CV%分布圖展示數(shù)據(jù)集中整體定量蛋白質(zhì)的方差分布（圖4）。結(jié)果顯示，進(jìn)樣量越低，蛋白質(zhì)定量方差越大。
文獻(xiàn)：
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.