導(dǎo)讀

說起引物，大家都再熟悉不過了。引物，在核苷酸聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量PCR，設(shè)計合適的引物是非常關(guān)鍵的一步。

普通PCR和熒光定量PCR的檢測方式具有較大的差別。熒光定量PCR實時監(jiān)測與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計方面，有什么相同點和不同點呢？今天小編就給大家匯總一下。

相同處：

▶  序列的查找是一致的。

▶  序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。

▶  選取合適的擴(kuò)增片段大小。

▶  避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對。

▶  避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。

▶  引物之間的Tm相差避免超過2℃。

▶  引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。

不同處：

熒光定量PCR 引物

▶  PCR產(chǎn)物長度：要求在300bp以內(nèi)，一般首選80-150bp之間。

▶  引物特異性：對引物要求高，盡量減少引物二聚體的產(chǎn)生，熔解曲線要求單一產(chǎn)物。

▶  擴(kuò)增效率：熒光定量 PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對定量，擴(kuò)增效率應(yīng)在90%—110%之間。

▶  多對目的基因同時擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來的引物條件會不同，需要設(shè)計盡可能條件一致的引物。

▶  目的基因含量比較低時，需要設(shè)計靈敏度比較高的引物。
 

普通PCR 引物

▶  普通PCR的擴(kuò)增長度，根據(jù)實驗的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。

▶  相對于熒光定量PCR，普通PCR對二級結(jié)構(gòu)要求較低。

▶  對擴(kuò)增效率要求不高。

▶  可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致。

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