IRAK1和IRAK4是組織中廣泛表達的經典激酶，而IRAK3是一種假激酶，只在骨髓細胞系中表達，缺乏激酶活性。迄今為止，沒有傳統(tǒng)小分子抑制劑靶向IRAK3，2020年，Degorce等報道了第一個選擇性降解IRAK3靶點的PROTAC分子，但相關研究沒有揭示降解后功能變化。IRAK3作為TLR通路的負調控因子，可能會降低先天免疫反應。在腫瘤微環(huán)境中，敲除IRAK3顯示骨髓細胞功能增強以促進抗腫瘤響應。與腫瘤細胞共培養(yǎng)的單核細胞顯示 TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表達降低，但 IRAK3 表達增加。相反，與野生型 (WT) 樹突狀細胞（DCs） 相比，IRAK3-/-小鼠樹突狀細胞的促炎細胞因子表達增加，從而誘導 T 細胞反應并導致腫瘤生長抑制，降解IRAK3可能成為免疫腫瘤治療中一個有吸引力新策略。IL-12是由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞產出的主要促炎細胞因子，通過誘導促IFN-γ細胞因子，在促進Th1介導的抗腫瘤反應、T細胞活化和增殖中發(fā)揮重要作用。

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC選擇性降解IRAK3來研究后續(xù)DCs中功能和表型變化。根據(jù)下圖在人單核細胞衍生的樹突狀細胞中基因編輯敲除IRAK3基因，采用基于毛細管電泳技術的Digital Western（也稱為Simple Western Wes系統(tǒng)）驗證基因敲除效率，2個供體顯示完全敲除，另一個顯示保留10% IRAK3蛋白表達，結果顯示通過CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表達水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通過檢測細胞上清液中細胞因子分泌水平，結果顯示IL-12p40分泌顯著增加，與對照相比，濃度增加了1.5到2倍。同時IL-12p70分泌也具有增長趨勢，但IL-10沒有影響。

 

采用PROTAC D-1和LPS處理的DCs中IL-12p40濃度增加與CRISPR/Cas9 KO實驗結果一致的，證明了兩種方法有效性，證明通過PROTAC蛋白降解劑對IRAK3靶點可成藥性。通過深入了解研究IRAK3生物學，擴大了PROTAC分子降解靶點庫，并支持了潛在治療靶點的基因編輯缺失和化學降解之間的相關性。
 

本研究主要利用Digital Western Blot技術檢測IRAK3靶蛋白表達水平，研究CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC蛋白降解技術處理后細胞蛋白表達，準確定量靶向蛋白降解研究過程量效關系。AbbVie公司研究再次證明了Digital Western Blot可快速地、可重復性精準定量內源性蛋白質表達，是PROTAC技術平臺構建的必備技術。

 

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注冊商標，其他商標和注冊商標是其各自所有者的財產。

 

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參考文獻

1. Rhyasen, G., Starczynowski, D. IRAK signalling in cancer. Br J Cancer 112, 232–237 (2015).

2. Ann Rowley, Brian S Brown, etc. Targeting IRAK3 for Degradation to Enhance IL-12 Pro-inflammatory Cytokine Production.ACS Chem Biol. 2022 May 17