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利用紫外法測定鮭魚精DNA熔解溫度(Tm)

瀏覽次數(shù):1523 發(fā)布日期:2022-7-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
蟬鳴聲聲入夏來,烈日高照,暑氣炎炎,歡迎來到一年一度的人間大火爐時(shí)節(jié)——夏季。夏天,我們享受著天然免費(fèi)的汗蒸和干蒸,不僅大腦熱到顫抖,連DNA都要化了,離變異也不遠(yuǎn)了。

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綜上可見,生物對溫度的變化是很敏感的,溫度的變化影響著世間萬物。從古至今,對于溫度的控制和熱量的利用,也在人類生活生產(chǎn)中扮演了至關(guān)重要的角色。在生命科學(xué)研究領(lǐng)域,溫度是實(shí)驗(yàn)中非常重要的一個(gè)參數(shù)。例如,使用紫外法測定DNA熔解溫度(Tm就是一項(xiàng)非常經(jīng)典的需要樣品控溫的實(shí)驗(yàn)。

DNA 的變性的特點(diǎn)是爆發(fā)式的, 變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的范圍。通常把DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為該DNA 的熔點(diǎn)或熔解溫度( melting temperature ) , 用Tm 表示。DNA 的Tm 值一般在70~85 ℃之間。DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈,是在一個(gè)相當(dāng)小的溫度范圍內(nèi)完成的,一系列物化性質(zhì)也發(fā)生改變: 260 nm 區(qū)紫外吸收值增高(增色效應(yīng)) , 粘度降低, 浮力密度降低等。所以,我們可以利用紫外可見分光光度計(jì)檢測DNA樣品在260nm處吸光度隨溫度的變化,對解鏈過程進(jìn)行監(jiān)測。

不同種類DNA的Tm值不同:G-C 的含量越高, Tm 越高(由于鳥嘌呤-胞嘧啶(G≡C)核苷酸之間有3個(gè)氫鍵,而腺嘌呤-胸腺嘧啶(A=T)之間有2個(gè)氫鍵,G≡C核苷酸解離所需能量大于A=T堿基對所需能量。), 由Tm 值可推算出GC含量。其經(jīng)驗(yàn)公式為: ( G-C)% = ( Tm - 69.3 ) ×2.44

在以下示例實(shí)驗(yàn)中,使用梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)UV7配備酷T(CuveT)恒溫器,測定20℃-95℃升溫范圍內(nèi)鮭魚精DNA在260nm處的吸光度變化,以監(jiān)測其變性過程。我們用各溫度點(diǎn)測得的吸光度繪制圖譜,可得到一條溫度-吸光度S形曲線,如下圖所示:

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圖:260nm處鮭魚精DNA的熔解曲線(案例來源梅特勒公眾號)
 
在此實(shí)驗(yàn)案例中,鮭魚精DNA的Tm值通過確定S形曲線的拐點(diǎn)來確定。經(jīng)測定和計(jì)算,鮭魚精DNA的Tm值為64.4℃,說明其G≡C堿基對的濃度相對較低。確定熔解溫度的另外一種方法是用切線法對S形曲線的拐點(diǎn)進(jìn)行圖形化評估。

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我司已為廣大相信光的實(shí)驗(yàn)奧特曼準(zhǔn)備好了應(yīng)用秘笈成套裝備輕松應(yīng)對需要對樣品進(jìn)行溫控的紫外實(shí)驗(yàn)。梅特勒-托利多超越系列紫外可見分光光度計(jì)可搭載酷T帕爾貼控溫系統(tǒng)或勞達(dá)(LAUDA)等水浴恒溫系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)對樣品精準(zhǔn)快速的溫度控制:
 
梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)+酷T帕爾貼控溫系統(tǒng)方案:

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梅特勒-托利多紫外可見分光光度計(jì)+勞達(dá)(LAUDA)水浴溫控系統(tǒng)聯(lián)用方案:

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來源:東南科儀
聯(lián)系電話:400-113-3003/020-66618088/010-62268660/021-52586771
E-mail:dongnan@sinoinstrument.com

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