稻瘟病是由真菌 Magnaporthe oryzae 感染引起，嚴(yán)重威脅水稻產(chǎn)量，甚至可能導(dǎo)致絕產(chǎn)。如何讓作物獲得廣譜抗病性，是植物與病原菌間的“軍備競賽”。在植物與病原菌互作中，植物建立了兩層免疫防衛(wèi)體系，即病原相關(guān)分子模式激發(fā)的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)（PTI）和效應(yīng)蛋白激發(fā)的特異性免疫反應(yīng)（ETI），兩者能夠協(xié)調(diào)并共同作用促進(jìn)防御代謝物產(chǎn)生并對抗病原體，然而它們具體如何協(xié)調(diào)，并激發(fā)廣譜抗性仍有待探究。

2021年12月16日，國際Top期刊Nature（IF 49.962）在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心何祖華等研究組，題為 “NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity” 的論文，揭示了一條全新廣譜免疫代謝調(diào)控通路：PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯通路，并證明水稻廣譜抗病蛋白NLR受體調(diào)控該代謝通路保護植物，協(xié)同整合PTI和ETI，賦予水稻廣譜抗病性的新策略，為農(nóng)作物抗病育種設(shè)計奠定理論基礎(chǔ)。其中，中科新生命提供了TMT蛋白質(zhì)組、泛素化蛋白鑒定服務(wù)。

研究材料
水稻（目標(biāo)基因敲除或過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻）

技術(shù)路線
· 步驟1：蛋白質(zhì)組及蛋白互作分析篩選廣譜抗性NLR蛋白的關(guān)鍵作用因子；
· 步驟2：PICI1在ETI和PTI中發(fā)揮功能；
· 步驟3：PICI1通過去泛素化作用穩(wěn)定OsMETS；
· 步驟4：OsMETS穩(wěn)定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性；
· 步驟5：PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解，PICI1的自然變異有助于亞種免疫分化。

研究結(jié)果
1. 蛋白質(zhì)組及蛋白互作分析篩選廣譜抗性NLR蛋白的關(guān)鍵作用因子
以往研究發(fā)現(xiàn)，水稻NLR受體蛋白PigmR具有廣譜抗稻瘟病能力，表明其可能整合了PTI和ETI兩種途徑以保證其廣譜抗性。為識別關(guān)鍵調(diào)控因子，首先通過TMT定量蛋白質(zhì)組，篩選Chitin誘導(dǎo)植物免疫后的關(guān)鍵差異蛋白（與PTI相關(guān)）；隨后通過酵母雙雜(Y2H)，篩選與PigmR受體相互作用的蛋白。結(jié)合兩者篩選結(jié)果，獲得交集的候選蛋白稱為PICIs （PigmR互作及chitin誘導(dǎo)蛋白)，并進(jìn)行后續(xù)深入研究。

圖1 關(guān)鍵免疫調(diào)控因子PICIs的篩選

2. PICI1在ETI和PTI中發(fā)揮功能
進(jìn)一步，通過免疫共沉淀及共定位等實驗，確認(rèn)了PICI1與PigmR相互作用。隨后，在野生型近等基因Pigm株系(nili -Pigm)中構(gòu)建PICI1基因敲除株系、PICI1基因過表達(dá)株系（PICI1- OE），發(fā)現(xiàn)較野生型和過表達(dá)株系相比，敲除株系（PICI1- KO）的抗病性顯著降低。接下來，進(jìn)一步分析PICI1在PTI中的作用，發(fā)現(xiàn)Chitin可誘導(dǎo)PICI1表達(dá)，且在PICI1敲除株系（PICI1-KO）中，Chitin誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生和病原體相關(guān)疾病表達(dá)被抑制，而在PICI1過表達(dá)株系中（PICI1-OE）得以增強。綜上表明，PICI1與PigmR相互作用，并介導(dǎo)ETI和PTI反應(yīng)。

圖2 PICI1通過與PigmR相互作用，參與PigmR介導(dǎo)抗病性與PTI反應(yīng)

3. PICI1通過去泛素化作用穩(wěn)定OsMETS
隨后蛋白序列結(jié)構(gòu)域分析及實驗確認(rèn)，表明PICI1是一種去泛素化酶。為鑒定其底物，進(jìn)行了PICI1的免疫共沉淀及質(zhì)譜分析（IP-MS）將得到的互作蛋白與Chitin誘導(dǎo)的泛素化變化蛋白相交，篩選到20個泛素化候選蛋白，其中包括一個在單子葉和雙子葉中高度保守的蛋氨酸（Met）合酶(LOC_Os12g42876)。結(jié)合體外及體內(nèi)等一系列實驗，發(fā)現(xiàn)PICI1存在時OsMETS1-Flag穩(wěn)定積累，綜上說明OsMETS1是PICI1的底物，PICI1通過去泛素化作用穩(wěn)定OsMETS。

圖3 PICI1是去泛素化酶，通過去泛素化作用穩(wěn)定OsMETS

4. OsMETS穩(wěn)定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性
隨后探究了OsMETS的抗病功能，確認(rèn)了Chitin或flg22處理引發(fā)OsMETS表達(dá)積累，蛋氨酸（Met）介導(dǎo)免疫作用可通過誘導(dǎo)病原體相關(guān)基因觀察到劑量依賴的Met介導(dǎo)的抗瘟性。綜上表明，OsMETs介導(dǎo)的的生物合成，并在抗稻瘟病中發(fā)揮了重要作用。由于Met是乙烯在植物免疫中的前體，用Met處理能增加乙烯的產(chǎn)量，故進(jìn)一步分析OsMETs是否通過提高乙烯合成發(fā)揮作用。實驗表明，采用ACC(乙烯前驅(qū)體)預(yù)處理增加了抗瘟性，而AVG(乙烯生物合成抑制劑) 預(yù)處理降低了抗瘟性�？傊�，OsMETS穩(wěn)定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性。

圖4 OsMETS穩(wěn)定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性

5. PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解，PICI1的自然變異有助于亞種免疫分化
由于水稻在與病原菌長期處于類似于“軍備競賽”的協(xié)同進(jìn)化中，通過PICI1互作分析找到了病原菌分泌的毒性蛋白（AvrPi9），其能通過降解PICI1，抑制水稻的基礎(chǔ)抗病性（PTI），以有利于病原菌的入侵。然而，水稻進(jìn)化產(chǎn)生的廣譜抗病NLR受體可以通過抑制病原菌毒性蛋白與PICI1的互作，保護并加強PICI1的功能，進(jìn)而激活更多的防衛(wèi)化學(xué)物質(zhì)（蛋氨酸—乙烯）的合成，以獲得廣譜抗病性。
最后，對3000份水稻品種的基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，PICI1啟動子具有秈粳分化的自然變異位點，與水稻對稻瘟病的田間抗性緊密關(guān)聯(lián)，從而為水稻抗病育種提供了新的靶點。

圖5 PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解，PICI1自然變異有助于亞種免疫

小編小結(jié)
本研究綜合利用蛋白質(zhì)組學(xué)、植物病理、分子遺傳等策略，鑒定到一條新的植物免疫代謝通路：PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯。證明去泛素化酶PICI1作為一個新的免疫調(diào)控蛋白，通過增強蛋氨酸合酶OsMETS的穩(wěn)定性，促進(jìn)蛋氨酸介導(dǎo)乙烯代謝通路，參與水稻對抗病原菌的過程中，并且證明該途徑是植物協(xié)同整合PTI和ETI兩層免疫系統(tǒng)的重要策略之一，為水稻抗病育種提供新策略。

值得一提的是，文中幾處關(guān)鍵因子的篩選利用了基于質(zhì)譜組學(xué)結(jié)果，如蛋白質(zhì)組學(xué)、泛素化等，說明組學(xué)技術(shù)是篩選關(guān)鍵調(diào)控蛋白的重要方法之一。中科新生命能夠提供蛋白質(zhì)組、修飾蛋白質(zhì)組等多種組學(xué)檢測服務(wù)，歡迎感興趣的老師前來咨詢。

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