MMPL3 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)及其抑制劑在治療結(jié)核病中的探究
作者首先解析了單獨的 MMPL3 分子的晶體結(jié)構(gòu)（圖1A）。MMPL3 的總體結(jié)構(gòu)中，PN 和 PC 結(jié)構(gòu)域是它的胞外可溶區(qū)，是質(zhì)孔結(jié)構(gòu)域的兩個亞結(jié)構(gòu)，PC 和 PN均是 β-α-β-α-β 的折疊方式。兩者相互纏繞，形成一個中央腔，連接到三個開口，GT、GF 和 GB，親水氨基酸的存在，可允許特定的分子進出。跨膜結(jié)構(gòu)域（TMN/TMC）共包含 12 個跨膜螺旋（圖 1B 和 C），TMH IV 和 TMH X 構(gòu)成跨膜螺旋束的核心區(qū)域。在這兩個螺旋之間，有兩對親水殘基（Asp256-Tyr646 和Asp645-Tyr257），它們間的氫鍵連接兩個螺旋。值得注意的是，MMPL3 的 Asp-Tyr 突變能夠使分枝桿菌在培養(yǎng)基中停止生長分裂。這一結(jié)論和 MMPL 在質(zhì)子傳遞中的重要作用具有一致性。
Figure 1. 來自恥垢分支桿菌 MMPL3 蛋白的總體結(jié)構(gòu)
隨后，研究團隊分別解析了 MMPL3 蛋白與四種抑制劑（SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant）復合物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，通過 MST（microscale thermophoresis）實驗測得 SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 四種抑制劑和 MMPL3 蛋白結(jié)合的 Kd 值分別是 1.65 μM、0.29 μM、0.16 μM 和 29.5 μM。
SQ109 是很有潛力的抗結(jié)核藥物，具有廣譜的抗菌活性，對結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的 MIC 值分別為 0.3-0.6 μM 和 9.6 μM，目前已完成臨床 II-III 期試驗。研究證實了 MMPL3 是 SQ109 的直接靶點，SQ109 作用于 MMPL3 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，嵌入 TMH 束中心，被 TMH IV、V、VI、X、XI、XII 所包圍（圖2A），破壞質(zhì)子傳遞中的 Asp-Tyr 對，阻斷該蛋白的質(zhì)子內(nèi)流通道，導致 MMPL3 的構(gòu)象重排（圖2）。
Figure 2. SQ109 結(jié)合后引起 MMPL3 的構(gòu)象重排
AU1235 對分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的 MIC 值分別為 0.6 μM 和 9.8 μM。研究發(fā)現(xiàn) AU1235 與 SQ109 在同一個口袋中結(jié)合。此外， AU1235 的結(jié)合模式與 SQ109 的結(jié)合模式相似。在結(jié)合時，AU1235 在 MMPL3 中誘導了與 SQ109 非常相似的構(gòu)象變化。兩個抑制劑和 MMPL3 蛋白結(jié)合的差異在于 AU1235 中的三氟苯基具有更強的疏水作用。
ICA38 對分枝桿菌的 MIC 值為 0.003 μM。由于 ICA38 的生物利用度較差，不適合作為候選藥物進一步開發(fā)，其衍生物 NITD-304 和 NITD-349 已被證明是很有潛力的治療耐藥結(jié)核病的臨床前候選藥物。研究發(fā)現(xiàn)，ICA38 結(jié)合 MMPL3 的模式和 AU1235、SQ109 相似。與 AU1235 和 SQ109相比，ICA38 的吲哚基團緊貼在通道頂部的疏水亞位點，產(chǎn)生的疏水作用強于 SQ109 和 AU1235。
作者還對成藥庫的藥物分子進行了篩選，驚喜發(fā)現(xiàn) Rimonabant 有可能是 MMPL3 蛋白的抑制劑。Rimonabant 是首個針對人源大麻素受體 CB1 的拮抗劑，具有治療肥胖癥的潛力。通過分析 Rimonabant 與 MMPL3 蛋白復合物的晶體結(jié)構(gòu)，作者證實了 MMPL3 蛋白是 Rimonabant 的直接靶點。結(jié)構(gòu)顯示，Rimonabant 阻斷了 MMPL3 的質(zhì)子內(nèi)流通道。
為了更加清楚形象的解釋 Rimonabant 的結(jié)合模式，作者將 Rimonabant 的 2,4 -二氯苯基環(huán)簡稱為“臂1”，4-氯苯基環(huán)簡稱為“臂2”，哌啶酰-1-氨基甲酰簡稱為“臂3”（圖 3D）。吡唑環(huán)(包括4-甲基)插入 TMH 束的中心，垂直于膜，與疏水殘基 Gly641、Leu642 和 Ile253 相互作用（圖 3C 和 D）。“臂1”占據(jù)了一個由 5 個脂肪族氨基酸側(cè)鏈包圍的疏水口袋（圖 3C 和 D）。“臂2”與 SQ109 的香葉尾方向不同，伸入鄰近的、由 Val245、Ile319、Val638 和 Leu708 側(cè)鏈形成的疏水亞位點（圖3 A、C 和 D）。“臂3”插入兩個 Asp-Tyr 對的中心，并通過與 Asp645 形成極性相互作用而破壞連接它們的氫鍵。當 Phe649 的苯環(huán)向下旋轉(zhuǎn)面向 Phe260 的芳香環(huán)時，Phe260 幾乎不受干擾，形成 π-π 相互作用（圖3C 和 E）。Rimonabant 與 MMPL3蛋白的這種結(jié)合模式不同于 SQ109 等抑制劑，與結(jié)合 CB1 受體的模式也極其不同。
Figure 3. Rimonabant 與 MMPL3 結(jié)合的獨特模式
SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 這四種抑制劑均結(jié)合在質(zhì)子傳遞通道中，該研究對這個結(jié)合口袋進行了分區(qū)，分為 S1、S2、S3、S4 和 S5 五個亞區(qū)。其中，SQ109、AU1235 和 ICA38 結(jié)合模式相似，占據(jù)了 S3、S4、S5 三個亞區(qū) (圖7B-D)，而 Rimonabant 比較特別，它還占據(jù)了 S1 和 S2 亞區(qū) (圖 4E)。這種藥物結(jié)合的結(jié)構(gòu)特點，對于抑制 MMPL3 這一靶點蛋白的抗結(jié)核藥物設計具有非常重要的指導作用。除了 S4 亞位點外，S1、S2、S3、S5 都是疏水的。S1 和 S2 相對較小，而 S3 和 S5 都比較大，足以容納大型疏水基團以增強結(jié)合(圖 4A)。這兩個 Asp-Tyr 對是 S4 亞位點的關鍵組件 (圖 4A)。四種候選藥物在結(jié)合時分別占據(jù)質(zhì)子傳遞通道的 3-5 個子位點 (圖 4B -4E)，破壞質(zhì)子傳遞通道中的 Asp-Tyr 對，從而阻斷底物轉(zhuǎn)運的質(zhì)子動力。圖中結(jié)構(gòu)信息的展示代表針對 MMPL3 蛋白有效抑制劑設計的一個重大進展。重要的是，這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和 MMPL3 活性化合物的 Kd 值表明，這些活性化合物在成為高效抗結(jié)核藥物之前還有很大優(yōu)化空間。
Figure 4. MMPL3 質(zhì)子傳遞通道的口袋分區(qū)（SQ109：洋紅色棒；AU1235：綠色棒；ICA38：橙色棒；Rimonabant：黃色棒)
小M 的小思考：
此外，為了研究抗藥突變對抑制劑結(jié)合的影響，作者分析了 13 個已知的 SQ109、AU1235 和 ICA38 衍生物突變位點，其中，Y257C 是暴露于 SQ109 和AU1235 的雙抗性突變。MST 數(shù)據(jù)顯示，這些抑制劑和突變蛋白的結(jié)合非常弱，這是因為 Tyr257 在穩(wěn)定親水性 S4 亞位點和增強 S5 亞位點與抑制劑結(jié)合中發(fā)揮了重要作用。同樣的，Ser293 突變?yōu)楸彼釃乐仄茐牧?SQ109 和 AU1235 與 MMPL3 靶蛋白的結(jié)合。諸如此類的突變?nèi)绾萎a(chǎn)生耐藥性仍有待進一步研究，但避免與這些產(chǎn)生耐藥性的突變殘基直接接觸是設計 MMPL3 二代抑制劑的一個合理策略，而另一個策略則是設計藥物構(gòu)象時注入靈活可變性（例如，更自由的可旋轉(zhuǎn)鍵）[1]。
參考文獻
[1] Tuberculosis. WorldHealth Organization. 16 February 2018. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis.
[2] Zhang B，et al. Crystal Structures of Membrane TransporterMmpL3, an Anti-TB Drug Target. Cell. 2019 Jan 24; 176(3):636-648.e13.
相關產(chǎn)品：
HY-14136
Rimonabant(SR141716) 是中心大麻素 1 (CB1) 受體高效的、選擇性的反向激動劑， Ki 值為 1.8 nM。Rimonabant (SR141716) 也能夠抑制分枝桿菌膜蛋白3 (MMPL3).
