三維細(xì)胞培養(yǎng)（Three-dimensional cell culture，3D細(xì)胞培養(yǎng)）這個(gè)名詞已然成為生物科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近幾年圍繞“3D細(xì)胞培養(yǎng)”公開發(fā)表的文章或評(píng)論數(shù)量上升迅猛，3D細(xì)胞培養(yǎng)衍生的類器官技術(shù)同樣成為研究學(xué)者的利器。2017年，《自然》雜志的子刊《Nature Methods》評(píng)價(jià)類器官為生命領(lǐng)域的年度技術(shù)；2019年，Organoids登上了《科學(xué)》雜志的封面，且為類器官特刊。悄然之間，類器官技術(shù)出現(xiàn)在各大頂級(jí)期刊雜志。2021年，“十四五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃更是把相關(guān)腫瘤類器官的研究列為首批重點(diǎn)專項(xiàng)任務(wù)。

圖1 3D/2D細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)量比較（左圖）；3D細(xì)胞培養(yǎng)的市場(chǎng)規(guī)模分析（右圖）

 

#3D細(xì)胞培養(yǎng)的概念

3D細(xì)胞培養(yǎng)是指將動(dòng)物細(xì)胞與具有三維結(jié)構(gòu)的支架材料共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在三維立體的空間生長(zhǎng)、增殖和遷移，構(gòu)成三維的細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-載體復(fù)合物，從而更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。

目前主要分為有支架和無(wú)支架的三維培養(yǎng)技術(shù)，其中依附支架的材料主要包括膠原和水凝膠等，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單；不依附支架的主要是通過(guò)物理方法進(jìn)行培養(yǎng)，主要包括微載體、磁懸浮、懸滴板等，這類操作復(fù)雜、成本投入較大。

圖2 2D培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）；利用VitroGel水凝膠3D培養(yǎng)的HCT116

 

 

#3D細(xì)胞培養(yǎng)的最新動(dòng)態(tài)

• 【Stem Cell Res Ther】利用VitroGel水凝膠包裹光活化的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞原位移植改善肥胖小鼠的糖代謝。

• 【Cell Mol Biol Lett】利用VitroGel水凝膠來(lái)研究經(jīng)MSC-CXCL12刺激后的巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)。

• 【Cell Stem Cell】利用Matrigel構(gòu)建人肺泡干細(xì)胞培養(yǎng)模型揭示對(duì)SARS-CoV-2的感染反應(yīng)。

• 【Cell】結(jié)合先進(jìn)的3D細(xì)胞培養(yǎng)和3D生物打印技術(shù)構(gòu)建體外人體的關(guān)節(jié)模型。

• 【Nat Commun】自動(dòng)化微流體平臺(tái)助力腫瘤類器官的藥物篩選研究。

 

#3D細(xì)胞培養(yǎng)與類器官的聯(lián)系

類器官（Organoids）是一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)而成的具備三維結(jié)構(gòu)的微器官，具有類似于真實(shí)器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并可以部分模擬來(lái)源（干細(xì)胞、腫瘤組織、病人來(lái)源等）組織或器官的生理功能。截至目前已有10多種不同組織、疾病模型及模擬發(fā)育的類器官問世。類器官作為一項(xiàng)重大的技術(shù)突破，已被公認(rèn)為生物科學(xué)領(lǐng)域研究的重要工具，并具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

從類器官的定義和來(lái)源來(lái)看，是將多能干細(xì)胞或患者來(lái)源的腫瘤組織等進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng)，從而形成相應(yīng)器官的自組織，并具有自我更新和自我組織的能力，故又稱“平皿里的器官”。綜上，類器官屬于3D細(xì)胞培養(yǎng)物，包含器官特異性細(xì)胞類型，可以表現(xiàn)出器官的空間組織和復(fù)制器官的某些功能。類器官重現(xiàn)了一個(gè)生理上高度相關(guān)的系統(tǒng)，在三維體系下可以研究復(fù)雜的問題。例如，疾病發(fā)作、組織再生和器官之間的相互作用。

圖3 利用VitroGel ORGANOID水凝膠進(jìn)行小鼠腸類器官的培養(yǎng)

 

#如何開展類器官研究

 

01 樣本來(lái)源

• 穩(wěn)定的細(xì)胞系：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞，永生化細(xì)胞系，原代細(xì)胞系等；

• 組織類：正常組織，腫瘤組織以及人源異種移植模型等。

 

02 培養(yǎng)體系

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12（適合克隆培養(yǎng)）等；

• 常用的生長(zhǎng)因子和小分子。

1. Wnt信號(hào)通路激活劑：R-Spondin 1，Wnt-3a；

2. 酪氨酸受體激酶的配體，刺激上皮細(xì)胞增殖：EGF；

3. TGF-β信號(hào)通路抑制劑，抑制上皮細(xì)胞分化：Noggin；

4. ROCK抑制劑，保持干細(xì)胞多能性：Y-27632。

 

03 3D培養(yǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)

• VitroGel水凝膠：無(wú)動(dòng)物源成分的功能性水凝膠，室溫下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單；

• Matrigel/BME等：小鼠肉瘤提取物，成分復(fù)雜，操作繁瑣。

 

04 類器官培養(yǎng)與應(yīng)用的簡(jiǎn)易流程圖

圖4 類器官培養(yǎng)流程圖

 

 

#類器官培養(yǎng)方法的比較

類器官的來(lái)源廣泛，樣本材料經(jīng)過(guò)不同方法處理后需要在體外進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建3D培養(yǎng)模型。不同細(xì)胞外基質(zhì)可采用的培養(yǎng)方法也會(huì)存在差異，但都可以為類器官體外培養(yǎng)提供生長(zhǎng)的微環(huán)境。其中VitroGel水凝膠為無(wú)動(dòng)物源成分的功能性水凝膠，室溫下與細(xì)胞培養(yǎng)基或含離子成分的溶液混合即可成膠，類器官培養(yǎng)方法多樣；而目前使用較多的Matrigel或其它含動(dòng)物源成分的基質(zhì)膠，所有操作或者材料需要在冰上進(jìn)行，且主要以圓頂（Dome）形式進(jìn)行類器官培養(yǎng)。現(xiàn)對(duì)兩類細(xì)胞外基質(zhì)用于類器官培養(yǎng)的操作方法進(jìn)行比較：

 

2D包被培養(yǎng)

主要將細(xì)胞外基質(zhì)先鋪板粘附凝固后再將細(xì)胞添加在表面，細(xì)胞會(huì)通過(guò)基質(zhì)表面的孔徑滲入到內(nèi)部，添加覆蓋培養(yǎng)基后培養(yǎng)形成類器官。

 

 

3D包裹培養(yǎng)

主要將細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞懸液按一定比例混合，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，待形成軟凝膠或固化后再添加覆蓋培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)形成類器官。

 

 

液滴式培養(yǎng)

主要利用VitroGel水凝膠的特性進(jìn)行特有的類器官培養(yǎng)。水凝膠與細(xì)胞懸液混合后形成軟凝膠后，仍具有流變性和一定的剪切力，允許以液滴的形式滴加在培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成類器官。

 

目前，類器官培養(yǎng)技術(shù)正處于技術(shù)爆發(fā)和科研成果井噴的階段，行業(yè)發(fā)展具有很大的前景，但挑戰(zhàn)也是并存的。例如，大多數(shù)類器官本身不具備血管化的結(jié)構(gòu)；如何在體外模擬腫瘤類器官與免疫細(xì)胞相互作用關(guān)系；類器官的重復(fù)性和一致性；以及類器官下游應(yīng)用的準(zhǔn)確性等�？傊�，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，助力再生醫(yī)學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的研究更上一層樓。

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參考文獻(xiàn)

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