活細(xì)胞多色熒光成像：多色同時成像的優(yōu)勢及注意事項
活細(xì)胞成像實驗是了解動態(tài)過程的關(guān)鍵。這類實驗使我們能夠觀察記錄活體狀態(tài)下的細(xì)胞，而不會可能因固定或終止不同活體過程而產(chǎn)生干擾性偽影。
通過活細(xì)胞成像可以觀察細(xì)胞、組織或整個生物體在其自然環(huán)境中的動態(tài)過程，而不僅僅是獲得終點圖像和數(shù)據(jù)。例如，您可以研究細(xì)胞或蛋白質(zhì)的共定位，以查看不同的靶點是否彼此相鄰，并觀察它們?nèi)绾蜗嗷プ饔谩?/span>
為什么使用多個熒光標(biāo)記很重要？在活細(xì)胞顯微成像中使用多通道方法可以同步觀察多個細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程，提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，從而為測量數(shù)據(jù)增加相關(guān)信息。通過這種方法可以研究細(xì)胞與蛋白質(zhì)相互作用、動態(tài)變化以及這些變化如何相互作用和影響。不過，使用單個熒光團(tuán)的實驗很常見，而使用兩個或多個熒光探針對活細(xì)胞成像可能會很復(fù)雜，并且必須仔細(xì)考慮幾個要點才能成功。本文將介紹有關(guān)成功設(shè)置多色活細(xì)胞實驗的一些關(guān)鍵方面。
選擇合適的熒光團(tuán)設(shè)置多色活細(xì)胞實驗時，首先要選擇合適的熒光團(tuán)，這一點至關(guān)重要。熒光團(tuán)必須與活體樣本相容，并具有光穩(wěn)定性，才能進(jìn)行長期成像。熒光蛋白標(biāo)記、活細(xì)胞染料、動態(tài)標(biāo)記（如 Ca2+ 指示劑）及其他用于標(biāo)記感興趣靶標(biāo)的方法是達(dá)到這類目的的合適工具。但是，由于發(fā)射光譜寬，以多通道方式研究活細(xì)胞過程時可供選擇的熒光染料仍然相當(dāng)有限。每使用一個額外的標(biāo)簽，找到具有高特異性和高信號輸出的激發(fā)/探測模式就變得更加困難。將兩個或多個熒光團(tuán)信號一起成像時，需要使用復(fù)雜的標(biāo)記策略最大程度減少光譜重疊。
在生理條件下成像無論使用細(xì)胞培養(yǎng)物、類器官、球狀體還是較小的模式生物，都必須使用近生理條件來確保樣本保持活力。在延時實驗中，某些條件必須保持最佳狀態(tài)，才能確保細(xì)胞不僅能夠存活，而且不會承受壓力，并保持真實的生理機能。通常情況下使用培養(yǎng)箱（37°C、二氧化碳、濕度，有時還包括在一段時間內(nèi)具有高穩(wěn)定性的氧氣）確保持續(xù)提供近生理條件。此外，選擇一種低自發(fā)熒光、不會干擾信號且不影響成像的介質(zhì)也大有好處。
視頻：RPE 細(xì)胞分裂的 12 小時共聚焦延時視頻，細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) eGFP-tubulin（青色）和 iRFP-Histone H2B（品紅色）。由美國巴爾的摩約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院荷蘭實驗室 C. Gliech 提供。荷蘭實驗室致力于研究各種控制染色體精確分布的分子機制，以及有絲分裂錯誤在人體健康和疾病中起到的作用。
圖像采集注意事項寬場顯微成像通常是活細(xì)胞成像的首選，因為它能夠更快、更溫和地成像。最先進(jìn)的寬場顯微成像使用 LED 光源和濾光片組。盡管有很多濾光片都可以用于各種不同的熒光團(tuán)組合，但是為了獲得用多個熒光團(tuán)標(biāo)記的樣本的正確圖像，需要考慮多個因素。
大多數(shù)用于活細(xì)胞成像的熒光團(tuán)都具有寬發(fā)射光譜。這一事實通常意味著各個探測通道之間會出現(xiàn)串?dāng)_現(xiàn)象，例如，您會在紅色探測通道中看到來自綠色通道的一些發(fā)射光。在活細(xì)胞成像實驗中使用多個標(biāo)記時，熒光光譜重疊現(xiàn)象很常見，因此為了確保看到想識別的細(xì)節(jié)，可以使用窄帶濾光片。但是，這種方法會導(dǎo)致靈敏度下降并影響結(jié)果，因為活細(xì)胞中的熒光團(tuán)信號水平通常較低，尤其是對于靶標(biāo)豐度稀疏的樣本或以內(nèi)源性水平表達(dá)的樣本。使用更多激發(fā)光來抵消靈敏度下降通常不可行，因為這種方法對樣本的危害性會增加（即光毒性增加）。
在活細(xì)胞實驗中，高速采集通常至關(guān)重要，特別是在研究快速動態(tài)過程時，如囊泡 觀察。 使用濾光片會導(dǎo)致速度受限，因為在改變每種顏色的濾光片組時必須依次成像。按順序采集圖像比同時采集圖像需要更多時間，因此在采集過程中可能會錯過樣本的快速運動，因為從一個圖像到下一個圖像時每種顏色都有更長的時間間隔。 此外，當(dāng) 兩種或多種顏色之間的直接比較 至關(guān)重要時，例如在 上述 囊泡 觀察 實驗中： 信號 甚至可能 在兩次 熒光團(tuán) 采集之間已經(jīng)移動， 從而加大數(shù)據(jù)解釋的難度。
改善活細(xì)胞成像的替代方案研究活細(xì)胞中多個探針之間的相互作用而獲得的大量信息可提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，因此人們開發(fā)了多種方法來拆分復(fù)雜的混合發(fā)射光信號。
為了能夠使用多個標(biāo)簽，以便從一個樣本中獲得更深入的認(rèn)識，您可以使用光譜圖像信息線性拆分方法，它可以分析每個熒光團(tuán)對總信號的貢獻(xiàn)。要進(jìn)行線性光譜拆分，必須為所有可能的參考光譜混合方式計算未知光譜與參考光譜之間的最小差值 (1)。這種方法通常用于對多種顏色成像，即使它們重疊。但是在寬場顯微成像中，您仍可能遺漏關(guān)鍵信息，因為必須對樣本中每個熒光團(tuán)依次成像，這會導(dǎo)致速度受限。
如果采用其他方法會怎樣？有一種方法可以快速拆分多種顏色，而不必?fù)?dān)心采集期間光譜重疊，也無需學(xué)習(xí)復(fù)雜的光譜拆分方法。
最近發(fā)表的一些文章介紹了一種基于相量的光譜拆分方法 (2, 3)。光譜相量分析可將每個像素的光譜成分轉(zhuǎn)換為二維圖中的一個位置。這樣就可以利用簡單的數(shù)學(xué)方法即時、可靠地分離不同染料的發(fā)射光。此外，它還可以僅基于光譜而不是強度來增加濾光——從而保留圖像的細(xì)微細(xì)節(jié)，同時減少可能會影響線性光譜拆分的噪聲。由于實際上消除了串?dāng)_以及自發(fā)熒光等干擾因素，選擇合適的熒光探針組合不再是問題，因此以這種方式成像可以更輕松地設(shè)置多通道活細(xì)胞成像實驗。
