本期給大家分享《乙型肝炎病毒核苷類似物交叉耐藥株RT區(qū)變異分析》，文章以基因克隆和測(cè)序?yàn)榧夹g(shù)背景，從142例黑龍江慢性肝炎患者中篩選出6例臨床上療效不佳、NAs耐藥（包括拉米夫定，阿德福韋，恩替卡韋，替比夫定）的患者，并以此為原型總結(jié)交叉耐藥變異株RT區(qū)的變異特點(diǎn)和規(guī)律，為交叉耐藥HBV感染的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床進(jìn)一步規(guī)范精準(zhǔn)治療提供了良好的參考。

核苷類似物(NAs)通過(guò)抑制多聚酶或逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮抗病毒作用，然而在宿主免疫反應(yīng)和藥物的選擇壓力下長(zhǎng)期使用NAs，HBV的各種變異和耐藥株會(huì)不斷出現(xiàn)。

這其中表現(xiàn)為兩個(gè)原因：

一是針對(duì)一種NAs，HBV往往會(huì)產(chǎn)生多個(gè)耐藥位點(diǎn)的聯(lián)合變異

二是針對(duì)多種NAs，HBV往往會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥

交叉耐藥導(dǎo)致病毒對(duì)多種藥物同時(shí)發(fā)生耐藥(多重耐藥)，使NAs抗病毒治療徹底失敗。

文章對(duì)6位交叉耐藥患者用藥情況及其他臨床指標(biāo)跟蹤，同時(shí)經(jīng)基因克隆測(cè)序，
結(jié)果顯示：6例體內(nèi)HBV基因型均為C型，產(chǎn)生交叉耐藥的相關(guān)性變異以rtM204V / I(YMDD)變異為主(50%)，部分YMDD變異株伴有rtL180M 變異(16.7% )、其他伴隨變異包括rtV173L(16.7% )，rtI80I(16.7%)。RT區(qū)次要變異伴隨位點(diǎn)rtL269I(40% )、rtQ333K(56.7% )、rtH337N(56.7% )，值得關(guān)注的是rtQ333K、rtH337N位點(diǎn)為臨床罕見位點(diǎn)，在本研究交叉耐藥患者中占有了較高的比例，對(duì)交叉耐藥患者的罕見位點(diǎn)檢測(cè)有臨床價(jià)值。

RT區(qū)次要罕見變異伴隨位點(diǎn)rtL269I、rtQ333K、rtH337N的出現(xiàn)增強(qiáng)了HBV YMDD 變異株在體內(nèi)的復(fù)制能力，并對(duì)交叉耐藥準(zhǔn)種所占比例起到了放大的效果，從而導(dǎo)致本研究中6例患者出現(xiàn)對(duì)拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋和替比夫定產(chǎn)生多重耐藥。需持續(xù)增加病例數(shù)量對(duì)不同耐藥位點(diǎn)間的相互影響做進(jìn)一步的觀察和驗(yàn)證。

在NAs的選擇壓力下，耐藥毒株多聚酶區(qū)域的原發(fā)耐藥突變會(huì)對(duì)病毒DNA復(fù)制的適應(yīng)性產(chǎn)生一定的影響，而代償性突變的發(fā)生增進(jìn)了病毒的復(fù)制能力，使原本并不利于病毒復(fù)制的原發(fā)耐藥突變能夠通過(guò)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)而傳給子代，HBV基因組的適應(yīng)性變異便成為導(dǎo)致NAs耐藥的重要原因之一。

【原發(fā)耐藥突變(primarydrug resistance mutation)】藥物作用靶點(diǎn)的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致突變的病毒株對(duì)治療藥物的敏感性下降。原發(fā)耐藥突變株對(duì)藥物的敏感性降低，但其復(fù)制能力低于野毒株。

【繼發(fā)耐藥突變(secondarydrug resistance mutation)或代償性耐藥突變(compensatorydrug resistance mutation)】在原發(fā)耐藥突變的基礎(chǔ)上，突變病毒株在其他位點(diǎn)發(fā)生突變，使突變的病毒復(fù)制能力部分恢復(fù)并對(duì)藥物的敏感性進(jìn)一步降低。

引自“2013版核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理專家共識(shí)”。

HBV在感染者體內(nèi)復(fù)制速度快，且DNA復(fù)制的忠實(shí)性較差，因此感染者一般均為多種毒株的混合感染，體內(nèi)的病毒呈高度特異性，這些因素決定了感染者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種池將由各種不同的病毒準(zhǔn)種組成，病毒準(zhǔn)種之間可能僅有1個(gè)或幾個(gè)堿基的變異。

【準(zhǔn)種(quasispecies)】HBV復(fù)制水平很高，但由于其聚合酶缺乏校正功能，因而復(fù)制過(guò)程中很容易參入錯(cuò)誤堿基形成變異株．這些變異株的特點(diǎn)各不相同，在一個(gè)HBV感染者體內(nèi)常形成以某一個(gè)優(yōu)勢(shì)株為主的相關(guān)突變株組成的病毒群稱為準(zhǔn)種，他是一個(gè)不斷變化的病毒群。

參考：吳珍萍,韓濤,高英堂,等。拉米夫定耐藥后序貫治療中HBV準(zhǔn)種的演變[J].世界華人消化雜志,2010,18(8):779-785.

6例患者初治應(yīng)用拉米夫定、阿德福韋或恩替卡韋單藥治療，出現(xiàn)臨床病毒學(xué)應(yīng)答不佳、無(wú)應(yīng)答，病毒學(xué)突破時(shí)應(yīng)用恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋挽救治療，但病毒學(xué)應(yīng)答差，出現(xiàn)臨床多重耐藥。

不少研究和指南把恩替卡韋作為首選NAs一線藥物，能夠降低長(zhǎng)療程治療下的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，單藥治療5年耐藥率僅為1.2%。然而，本文研究發(fā)現(xiàn)P6患者長(zhǎng)期應(yīng)用恩替卡韋治療引起rtM204I變異，而且對(duì)替比夫定和阿德福韋產(chǎn)生交叉耐藥。

因此，選擇具有高耐藥基因屏障、低耐藥率的藥物可以降低抗HBV的耐藥風(fēng)險(xiǎn)的說(shuō)法還需慎重，盡量避免單藥序貫治療方式。

Ps：以上內(nèi)容僅代表本篇解讀文章的觀點(diǎn)。

解讀文獻(xiàn)：

滕旭，林樂(lè)勛 ，陳麗玲 ，梁爽，徐暉 ，谷鴻喜.
《乙型肝炎病毒核苷類似物交叉耐藥株RT區(qū)變異分析》

備注：該研究為黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12511179）

文章通訊作者

谷鴻喜

教授、博士生導(dǎo)師

黑龍江省教學(xué)名師，曾任哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室主任，黑龍江省重點(diǎn)學(xué)科帶頭人，病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心主任。

現(xiàn)任中華醫(yī)學(xué)會(huì)病毒學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員，多年從事乙型肝炎病毒（HBV）與人乳頭瘤病毒（HPV）的致病機(jī)制研究。

曾承擔(dān)國(guó)家、省級(jí)科研課題17項(xiàng)。共獲科研獎(jiǎng)勵(lì)28項(xiàng)，其中省部級(jí)以上15項(xiàng)，現(xiàn)承擔(dān)國(guó)家“十二五”重大專項(xiàng)子課題1項(xiàng)。多年來(lái)發(fā)表SCI收錄論文14篇，核心期刊發(fā)表論文100余篇，1990年至今，共指導(dǎo)50名研究生，其中31名碩士生，20名博士生。

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乙肝病毒耐藥和分型檢測(cè)（Sanger測(cè)序法）

 

• 檢測(cè)常見的YMDD突變M204V/I，也可以同時(shí)獲得RT逆轉(zhuǎn)錄區(qū)的其他多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)，包括有文獻(xiàn)支持的A181V/T，N236T，I169T，L180M，T184A/G/S/I/L/F，S202G/I，M250V/L/I，V173L，A194T，對(duì)未知耐藥位點(diǎn)和發(fā)生變異的病毒有很好的臨床和科研參考價(jià)值
• 檢測(cè)六種主要乙肝藥物（拉米夫定，替比夫定，恩替卡韋，恩曲他濱，阿德福韋和替諾福韋）的耐藥以及乙肝病毒分型信息
• 分子診斷技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)，耐藥和分型一步到位
• 國(guó)內(nèi)唯一獲得CFDA的Sanger測(cè)序法的乙肝耐藥分析檢測(cè)
• CFDA注冊(cè)證：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401444號(hào)