英文標題：Detection of Rare Mutations in  EGFR-ARMS-PCR-Negative LungAdenocarcinoma  by Sanger Sequencing

單位及作者：廣州呼吸疾病研究所和廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院張潔霞主任團隊成員及相關(guān)研究人員。

發(fā)表期刊：YONSEI MED J

研究背景

肺癌是常見的胸部惡性腫瘤， EGFR基因突變率在高加索人群肺癌患者中為5-10％，在亞洲人非吸煙患者中為60-70%^[1]。與標準化療相比，EGFR敏感突變的NSCLC患者對EGFR抑制劑（包括吉非替尼和厄洛替尼）高度敏感。因此，EGFR突變的準確檢測對EGFR突變陽性非小細胞肺癌患者臨床管理中起著關(guān)鍵作用。

目前，檢測EGFR突變的方法包括Sanger測序，突變擴增系統(tǒng)（ARMS），焦磷酸測序，高分辨率熔解分析和高通量測序。Sanger測序仍然是臨床實踐中EGFR突變檢測的金標準，并且可以檢測到未知的EGFR突變。

研究目的

用Sanger測序法檢測ARMS-PCR方法未檢測到的潛在EGFR基因未知突變。

材料和方法

廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的200例樣本，包括用ARMS方法檢測的100例EGFR基因突變陰性樣本和100例EGFR突變陽性樣本。用Sanger測序進行檢測，分析兩種方法學(xué)和靈敏度以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的結(jié)果。

提�。菏褂肣IAamp DNA FFPE組織試劑盒從福爾馬林固定的石蠟包埋的腫瘤組織中提取DNA。 再使用NanoDrop1000分光光度計測量其濃度（ng / mL）和吸光度（A260/ 280比率）后，將基因組DNA保存在-20±5℃。

Sanger測序：使用廣州立菲達安診斷產(chǎn)品技術(shù)有限公司EGFR突變檢測試劑盒進行擴增。 使用ABI 3100遺傳分析儀（AppliedBiosystems）進行測序和數(shù)據(jù)收集。

ARMS qPCR：使用ADx-ARMS EGFR 21檢測試劑盒檢測常見的EGFR突變。

結(jié)果及討論

1.   在100例ARMS陰性樣品中，三例通過Sanger方法檢測到突變呈陽性，并且確認了97例陰性樣品。

2.   ARMS方法檢測為陰性Sanger測序方法檢測為陽性的三例樣本突變情況為：c.2237_2251>TTC (complex)僅在cosmic的數(shù)據(jù)庫中報道了1次,c.2231_2232ins18 (insertion)在cosmic的數(shù)據(jù)庫中報道了6次, and c.2515G>A (substitution, position 2515, G→A)在數(shù)據(jù)庫中報道了4次。ARMS方法僅可以檢測外顯子18-21中的29個EGFR突變位點，該方法學(xué)因設(shè)計缺陷會漏檢。Sanger測序法檢測位點全面可以檢測未知和罕見突變。

3.   在EGFR-TKI治療方面，Sanger測序或ARMS檢測的EGFR陽性患者的中位PFS分別為11.1個月和10.9個月（95％CI，10.7-11.3月），這種差異并不顯著。高EGFR突變豐度患者PFS為12.4個月高于EGFR突變豐度低的患者（10.7-11.3月）。接受EGFR-TKIs的c.2237_2251>TTC突變患者或c.2231_2232ins18突變患者的PFS分別為3個月和6個月。EGFR-TKI治療4個月后，1例c.2515G> A突變患者失訪。

在EGFR突變非小細胞肺癌患者中，與EGFR野生型肺癌患者相比，EGFR-TKI治療顯著提高了生存率。EGFR突變位于外顯子18〜21，可作為EGFR-TKIs功效的預(yù)測因子。 因此，EGFR突變的檢測在非小細胞肺癌患者管理中起著關(guān)鍵作用。目前兩種主要的檢測方法是ARMS和Sanger測序。Sanger測序是金標準， ARMS僅限于檢測已知的突變。每個反應(yīng)系統(tǒng)只能檢測到預(yù)先指定的基因突變。因此，如果必須分析未知區(qū)域，則需要大量樣本和重新設(shè)計引物對，使得該方法昂貴。Sanger測序可以以相對較低的成本分析未知的DNA序列。

研究結(jié)果表明，Sanger測序可推薦用于EGFR重新檢測和手術(shù)標本的初步檢測。我們確定EGFR-TKI治療后具有高EGFR突變豐度的患者具有更好的結(jié)果。根據(jù)以前的報道，EGFR突變豐度可以預(yù)測晚期NSCLC EGFR-TKI治療的結(jié)果。 因此，在臨床實踐中，Sanger測序為醫(yī)師提供了額外的信息，以預(yù)測患者是否可以從EGFR-TKI獲益。

     Sanger測序可以檢測罕見的EGFR突變，并且適用于重新確定EGFR突變情況。 具有高突變豐度的NSCLC患者對EGFR-TKI治療具有更好的效果。 需要更多臨床試驗來評估EGFR-TKIs在罕見EGFR突變患者中的療效。

原文鏈接：https://doi.org/10.3349/ymj.2018.59.1.13

部分參考文獻：

1.    Tan DS, Mok TS, Rebbeck TR. Cancer genomics: diversity and disparity across ethnicity and geography. J Clin Oncol 2016;34:91–101

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EGFR基因突變檢測（Sanger 測序法）
 

• 評估EGFR-TKI類的藥物敏感性和耐藥，如吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特羅凱）指導(dǎo)臨床用藥
• 基因檢測金標準技術(shù)，靶向用藥效果更顯著
• 檢測非小細胞肺癌患者EGFR基因18-21共4個外顯子40多種基因突變
• 有效減少稀有突變的漏檢
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