BONE RES 椎間盤單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜精準揭示人類椎間盤細胞亞型
本文作者：Christine Zheng
陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心
隨著社會老齡化程度不斷升高，導(dǎo)致椎間盤退行性疾病的發(fā)病率日漸上升，并呈年輕化趨勢。椎間盤退行性疾病（DDD）是導(dǎo)致腰腿部位疼痛的主要原因，不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且對社會的醫(yī)療和經(jīng)濟資源帶來了沉重的負擔。
目前對于DDD的治療，主要依靠臥床、康復(fù)治療、藥物、介入及手術(shù)治療等手段，但這些手段只能減輕患者的癥狀，很難重建椎間盤（IVD）的穩(wěn)態(tài)環(huán)境。因此，急需深入探索椎間盤生理與病理機制，對椎間盤退行性疾病的治療具有重大指導(dǎo)意義。由于椎間盤細胞的高度異質(zhì)性以及復(fù)雜的細胞微環(huán)境，以往的研究通過bulk RNA測序解析椎間盤內(nèi)分子事件已很難滿足深入研究的需要，導(dǎo)致椎間盤的生理與病理機制仍然遠未闡明。
近日，陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（重慶大坪醫(yī)院）骨科 劉鵬課題組 與中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 劉兵課題組 聯(lián)合，在陸軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（重慶大坪醫(yī)院） 陳林課題組 的支持下，繪制了首個人類椎間盤細胞圖譜，在Bone Research發(fā)表了題為 Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs的封面研究論文。
研究人員采集了11個椎間盤，并且對髓核、纖維環(huán)、軟骨終板組織進行分離，分別從以上組織中分離提取細胞，對細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。
在經(jīng)過質(zhì)控和多連體排除后，作者對108108個單細胞進行了測序，通過對2651個差異表達基因（DEGs）進行分析，并對測序數(shù)據(jù)進行tSNE可視化處理，最終得到了9個亞群。
這些亞群包括3個SOX9+ 軟骨細胞亞群、脊索細胞、基質(zhì)細胞、周細胞、內(nèi)皮細胞、髓核祖細胞以及血細胞。
隨后，作者對樣本進行了免疫組化染色，驗證了幾個主要細胞亞群在椎間盤中的空間定位(圖1)。
此外，為了驗證這種椎間盤細胞的異質(zhì)性在物種間具有高度的保守性，作者比較了人類與大鼠間椎間盤細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)在人類椎間盤的細胞亞群在大鼠椎間盤中同樣存在，包括髓核祖細胞，內(nèi)皮細胞，以及周細胞。
圖1：健康人椎間盤中AF（纖維環(huán)）NP（髓核）CEP（軟骨終板）的免疫組化染色
作者通過進一步的研究，根據(jù)功能的差異，將椎間盤軟骨細胞分為三類：
1、調(diào)控型軟骨細胞通過活躍的生長因子表達和成軟骨信號通路調(diào)控，在軟骨ECM穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。
2、高度分化的穩(wěn)態(tài)軟骨細胞處于靜息狀態(tài)，主要負責ECM的沉積。3、效應(yīng)型軟骨細胞處于高代謝活性狀態(tài)，與維持椎間盤中ECM的合成密不可分，并且具有PRG4高表達的特性，能夠降低剪切壓力與感染的損傷，對關(guān)節(jié)具有保護作用。
此外，作者團隊通過免疫染色發(fā)現(xiàn)，在髓核區(qū)域內(nèi)存在一群PDGFRA+PROCR+的軟骨祖細胞亞群，這群細胞具有潛在的干性，并且特異性表達PRRX1（圖2）。
圖2：免疫熒光染色顯示PDGFRA/PROCR/PRRX1在人類椎間盤細胞內(nèi)的共表達情況
隨后，作者通過流式細胞分選，將不同的細胞亞群進行了純化富集。
通過體外實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)與PROCR-細胞亞群相比，PROCR+亞群具有很強的體外克隆形成能力。免疫熒光染色結(jié)果提示，在PROCR+細胞亞群中，軟骨生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子p-SMAD3高度活化（圖3）。最后的體外分化實驗證實，PROCR+祖細胞具有成骨、成軟骨以及成脂的三系分化能力（圖4）。
圖3：免疫熒光染色揭示PROCR+ 與PROCR- 亞群中p-SMAD3的表達差異
圖4：PROCR+亞群經(jīng)過成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)后的茜素紅、油紅O、阿爾新藍、蕃紅O-固綠染色
綜上，該研究通過單細胞表達譜測序，首次繪制了人類的椎間盤單細胞圖譜，在單細胞水平上定義了軟骨細胞亞群，讓我們對椎間盤細胞的異質(zhì)性有了全新認識；并且作者在空間上對這些不同的亞群進行了解析和定位，通過基因分析揭示了它們的調(diào)控特征。
此外，作者團隊在髓核中鑒定得到一群具有干性潛能的祖細胞，為人類椎間盤退行性疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
文中組織切片的圖像主要利用奧林巴斯VS200研究級全玻片掃描系統(tǒng)獲得，該系統(tǒng)支持明場與熒光等五種常見的觀察方法，通過配置的X Line高性能物鏡，可以為用戶提供平場性更好的圖像；自動聚焦和自動樣品檢測功能可以使系統(tǒng)的拍攝效率大大提高，同時不失精準；TruAI深度學(xué)習(xí)技術(shù)的強大功能，可以準確識別出樣品的形態(tài)特征，并且可以準確分割目標區(qū)域，在簡單易學(xué)的前提下幫助用戶節(jié)約分析圖像的時間。
此外，細胞的免疫熒光染色圖像主要通過奧林巴斯全新一代超高分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)SpinSR10獲得，該系統(tǒng)具有奧林巴斯特有的超高分辨模塊，無需特殊熒光標記染料，XY分辨率可達到110nm，輕松解析精細結(jié)構(gòu)；基于轉(zhuǎn)盤的共聚焦掃描單元可以實現(xiàn)高幀率的圖像采集，不錯過每一個瞬間；該系統(tǒng)極低的光毒性對標本的破壞很小，尤其適用于活細胞的觀察。
陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）骨科 劉鵬教授 與 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 劉兵研究員 為該論文的共同通訊作者，甘翼搏 博士后與 賀健 博士為論文的共同第一作者，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心為第一完成單位。該工作也得到了陸軍特色醫(yī)學(xué)中心陳林教授課題組的參與和支持。
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