腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）是一種常用的工具病毒，因其具有低免疫原性、高安全性及感染宿主范圍廣等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種體內(nèi)研究，例如，將攜帶有特定基因序列的AAV注射至小鼠體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)目的基因的過表達(dá)、敲低或敲除。近年來，基因治療領(lǐng)域發(fā)展迅速，無論是基礎(chǔ)研究還是產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化都取得了重大突破，而AAV是基因治療最重要的一種遞送載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前正在進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)中，AAV占了所有病毒載體的一半以上。這除了AAV具有體內(nèi)安全性高的優(yōu)勢(shì)外，還有個(gè)很重要的因素是，AAV具有良好的組織特異性。

基因的表達(dá)具有組織特異性，即同一基因在不同種類的組織或細(xì)胞中表達(dá)存在差異。在我們進(jìn)行基因功能研究時(shí)，常需要在小鼠體內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行組織特異性調(diào)控，即在特定的組織或細(xì)胞中表達(dá)外源序列而不影響其他組織。

那么，通過AAV實(shí)現(xiàn)體內(nèi)特異性調(diào)控要怎么做呢？常見的有4種策略：通過原位注射、組織特異性血清型、特異性啟動(dòng)子和Cre-loxp系統(tǒng)，下面就來給大家一一介紹。

原位注射
原位注射，顧名思義就是直接將AAV注射到想要表達(dá)的組織中，如腦立體定位注射、肌肉注射、心肌注射等。原位注射可讓AAV對(duì)目標(biāo)組織快速感染，并很少擴(kuò)散至全身，從而降低對(duì)其他正常組織器官的影響。但可進(jìn)行原位注射的組織要求是足夠厚實(shí)的實(shí)質(zhì)組織或相對(duì)封閉的腔間隙，因此目前能進(jìn)行AAV原位注射的組織類型并不多，而且像腦立體定位注射、玻璃體腔內(nèi)注射等原位注射具有較高的操作門檻。

目前常用組織原位注射方式如下表所示：
 

表1. 不同組織原位注射方式[1]

組織特異性血清型
AAV的血清型主要由AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)所決定，不同的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)識(shí)別不同的細(xì)胞表面受體，因此不同血清型的AAV會(huì)影響其感染效率、組織親和性以及開始表達(dá)的時(shí)間等。
 

表2. 部分AAV組織特異性血清型[2]

從上表可看出，目前AAV的血清型種類并不多，因此科學(xué)家也在積極地對(duì)AAV衣殼蛋白進(jìn)行改造，開發(fā)出更多的、對(duì)特定組織感染能力更強(qiáng)的血清型AAV。例如，研究人員開發(fā)出了一種可用于耳聾基因治療的AAV新變體，命名為AAV-ie（AAV-inner ear），其能夠高效靶向小鼠內(nèi)耳組織，且在內(nèi)耳支持細(xì)胞上表現(xiàn)出比AAV1、AAV6、AAV8、AAV-DJ等血清型具有更高的感染效率。
 

圖1. AAV-ie能高效感染耳蝸支持細(xì)胞[3]

組織特異性啟動(dòng)子
雖然不同血清型AAV對(duì)不同組織的感染具有傾向性，但仍難避免感染其他非靶向組織，這時(shí)候便需要利用多種組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子來提高AAV的特異性。組織特異性啟動(dòng)子是指在該啟動(dòng)子調(diào)控下，外源基因一般只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)。Bilal等采用Cre重組酶雙熒光報(bào)告基因小鼠（mT/mG）作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究NPPA和Myl2啟動(dòng)子在心臟腔室特異性活性，最后將AAV9基因特異性表達(dá)載體應(yīng)用在心臟腔室中進(jìn)行基因特異性表達(dá)研究，促進(jìn)人們對(duì)心臟病的了解，有助于心臟病基因療法的開發(fā)。
 

圖2. Nppa和Myl2啟動(dòng)子插入表達(dá)Cre的AAV9載體中[4]

Cre-loxp系統(tǒng)
除此之外，基于Cre-loxp系統(tǒng)的AAV和工具小鼠聯(lián)用方案也被越來越多的應(yīng)用。Cre是一種重組酶，可以識(shí)別催化兩個(gè)Loxp位點(diǎn)之間的片段發(fā)生同源重組，并根據(jù)兩個(gè)loxp位點(diǎn)的方向，造成DNA的缺失、易位等現(xiàn)象。從而實(shí)現(xiàn)目的基因的基因敲除、序列翻轉(zhuǎn)以及基因轉(zhuǎn)座。

因此，我們可向Cre小鼠中注射含loxp位點(diǎn)的AAV，從而在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的基因過表達(dá)或干擾表達(dá)；同樣，我們可向含loxp位點(diǎn)的flox小鼠中注射可表達(dá)Cre的AAV，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。

Sun等使用 Cre-loxp系統(tǒng)注射到小鼠VMH（腹內(nèi)側(cè)下丘腦）中，特異性敲除初級(jí)纖毛相關(guān)基因，并觀察到了小鼠的代謝失調(diào)和骨骼穩(wěn)態(tài)異常，從而證實(shí)其在調(diào)節(jié)能量和骨骼穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的作用。
 

圖3. VMH特異性初級(jí)纖毛KO小鼠骨骼生長增加[5]

小結(jié)
綜上所述，我們對(duì)四種AAV的組織特異性調(diào)控策略進(jìn)行了如下總結(jié)：
 

表3. 四種策略綜合比較

在實(shí)際研究中，大家可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的特異性策略，也可聯(lián)合多種特異性調(diào)控策略，多管齊下。例如，同時(shí)采用原位注射+特定血清型+特異性啟動(dòng)子。三重保證體內(nèi)基因的特異性調(diào)控。

參考文獻(xiàn)：
[1]高凱, 王軍志. 不同血清型腺相關(guān)病毒載體組織表達(dá)差異的研究進(jìn)展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2007, 14(004):388-392.

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[3]Tan, Fangzhi et al. “AAV-ie enables safe and efficient gene transfer to inner ear cells.” Nature communications. 10,1 3733. 19 Aug. 2019, doi:10.1038/s41467-019-11687-8

[4]Bilal, Alina S et al. “Optimizing Adeno-Associated Virus Serotype 9 for Studies of
Cardiac Chamber-Specific Gene Regulation.”
Circulation. 143,20(2021):2025-2027. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.052437

[5]Sun, Ji Su et al. “Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis.”The Journal of clinical investigation.131,1(2021):e138107. doi:10.1172/JCI138107

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