病毒載體包裝過程是復雜的，在做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題。為了讓大家在病毒包裝這塊少走彎路，《細胞基因編輯小課堂欄目》特邀賽業(yè)生物細胞生物學產(chǎn)品經(jīng)理針對病毒包裝常見的問題為大家進行經(jīng)驗總結(jié)與心得分享。繼慢病毒包裝之后，我們的腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）包裝常見問題解答也推出了上下兩篇。今天我們接著進行AAV包裝常見的問題解答：

Q1：AAV的注射方式，有尾靜脈注射也有局部原位注射，該怎么選？
AAV的體內(nèi)注射（給藥）方式分為系統(tǒng)性給藥和局部給藥，系統(tǒng)性給藥主要有尾靜脈、頸靜脈、眼眶靜脈和腹腔靜脈給藥；

局部給藥方式常見的包括腦立體定位、肌肉定點注射、心肌原位注射、玻璃體腔內(nèi)注射、關(guān)節(jié)腔注射等；

系統(tǒng)性給藥是特點是病毒注射的體積較大，一般需要100~1000μl不等，病毒在體內(nèi)擴散的范圍廣，一般系統(tǒng)性給藥的方式操作較為簡單，給藥比較方便；

局部給藥則病毒注射量要求較少，一般100μl以內(nèi)，但對滴度要求較高；由于是直接將AAV遞送到目標組織，局部給藥會有更好的靶向性，如果是臨床基因治療，局部給藥注射的病毒量少，因此病理毒性會更小。

Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才夠呢？
影響AAV注射總量的因素很多，比較重要的有血清型、目標組織類型、注射方式（局部or全身）、動物模型（如大鼠or小鼠）等，對于有文獻報道的，可參考文獻的注射方法，最好設置幾個不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心臟組織（心肌細胞），可采用尾靜脈注射也可采用心肌多點注射的方式，尾靜脈注射推薦1011 vg/mL，100μL；原點注射則推薦1010 vg/mL，20 μL/點。

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Q3：AAV注射后多久起效？有辦法縮短其表達時間嗎？
在我們的上期有提到，AAV進入細胞后需經(jīng)歷一個從單鏈DNA變成雙鏈DNA的過程，因此，目的基因開始表達所需的時間較長，一般在1周左右或以上可以檢測到，這個也跟目的基因相關(guān)，不同基因的表達高峰時間是不同的。

另外，可采用自互補AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表達速度，scAAV是通過改造其中的一個ITR使得AAV可形成二聚體，其進入細胞可直接進行表達，在多種組織中表達更迅速且表達水平更高。但缺點是，scAAV的包裝容量進一步縮小，約為AAV的一半，因此只能用于基因片段較小的研究。

Q4：AAV體內(nèi)注射純化的目的是什么？
如果是用于體外感染細胞的病毒，一般不用純化，但對于用于注射至體內(nèi)的病毒，無論是慢病毒還是AAV，均有必要進行純化。這是由于病毒在包裝生產(chǎn)過程中，未經(jīng)純化的病毒液含有大量的病毒外殼、細胞（293T）內(nèi)毒素、破損顆粒、及細胞碎片等，這些物質(zhì)如果隨病毒一起注射到動物體內(nèi)，可能會引發(fā)強烈的免疫反應，從而影響動物的生存狀態(tài)。另外病毒純化也是一個濃縮的過程，有利于后續(xù)的稀釋使用。

Q5：為什么AAV是目前基因治療領域最熱門的載體？
這是因為AAV具備以下優(yōu)勢：

1、宿主范圍廣：分裂和非分裂細胞；

2、安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病AAV；ITR和rep/cap獨立質(zhì)粒表達；

3、免疫原性低：對動物或人體造成的免疫反應小，幾種病毒載體中相對最小；

4、靶向性好：多種血清型，組織特異性。

但目前AAV并不是完美的，仍有許多需要優(yōu)化和改進的地方，如特異性還有待提高，從而減少AAV的使用劑量，降低毒理風險；通過載體改造提升載體容量，解決較大片段基因治療的問題；另外還需要開發(fā)更多具備不同功能的AAV，如跨血腦屏障、跨突觸等。

本文來自賽業(yè)生物(www.cyagen.com)