慢病毒（Lentivirus，LV）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）改造而來的一種病毒載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒可將特定基因片段隨機、穩(wěn)定地整合到宿主細胞的基因組中，實現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的表達目的產(chǎn)物，因此，目前慢病毒載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因的表達調(diào)控如過表達，干擾和基因敲除。

然而，在做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題，賽業(yè)生物具有多年分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)相關(guān)實驗技術(shù)的研究經(jīng)驗的細胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理針對常見的問題整理了一份慢病毒包裝FAQ，希望能解答您關(guān)于慢病毒包裝的困惑，上篇回顧請點這里：慢病毒（LV）包裝的常見問題及解答。今天我們接著進行慢病毒包裝常見的問題解答：

慢病毒載體最大可插入多大的片段？
慢病毒載體的載量為6-6.5kb左右，但一般建議插入的片段大小不超過5kb，這樣包裝出來的病毒滴度較高，若超過6kb則會顯著降低病毒滴度。實際病毒包裝中，我們常需要插入報告基因（如GFP）和抗性基因（如Puro），這使得目的片段的容量進一步縮小至3kb左右。

我們目前通過載體優(yōu)化，例如刪去不必要的基因，減小啟動子長度，可使目的基因的片段容量擴大到4kb左右。

怎么確認(rèn)我的細胞需要多少病毒量才夠？那么多規(guī)格我該怎么選？
由于慢病毒的感染譜很廣，可以感染分裂期和非分裂期的細胞，對于大部分的細胞類型，采用1×108 TU/ml的規(guī)格即可滿足要求，另外由于目前慢病毒多用于體外細胞的感染而少用于體內(nèi)注射，因此非純化亦可。

對于難感染的細胞，如原代細胞，需要較高的MOI，需要的病毒量也較多，建議選高規(guī)格，如1×108 TU/ml。

對于較為少見的細胞類型所需要的病毒量，可通過參考文獻或預(yù)實驗確定。

你們是用什么方法來檢測病毒滴度的？可靠嗎？
在上篇有講到，慢病毒滴度的測定方法主要有4種，即Elisa法檢測病毒顆粒中p24蛋白，PCR法檢測病毒顆粒RNA和檢測整合到基因組的病毒DNA，以及通過FACS檢測熒光蛋白的表達水平。

我們采用的是定量PCR檢測整合到細胞（293T）基因組中病毒DNA的方法，此方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確。因為ELISA和檢測病毒RNA的方法檢測的只是病毒顆粒的量，包括無活性的病毒顆粒，這會使得滴度檢測結(jié)果偏高，而我們實驗是需要有活性的慢病毒才能發(fā)揮轉(zhuǎn)染作用；FACS法所檢測的熒光蛋白則受到啟動子及熒光蛋白在目的細胞表達水平的影響，會使得檢測結(jié)果偏低。

都能轉(zhuǎn)染細胞，LV和AdV選哪個？
慢病毒由于可以插入細胞基因組，可以實現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的長時間表達；而腺病毒不整合到基因組，表達時間相對于慢病毒較短，一般兩三周這樣。

腺病毒的感染效率很高，顯著高于慢病毒，大部分細胞的感染效率均能達到95%以上，所以對于“頑固”細胞，可以考慮用腺病毒。

慢病毒的包裝周期相對較短，一般一個半月左右，但包裝的病毒滴度也相對較低（一般108 TU/ml）；腺病毒包裝則較為繁瑣，通常需要2個月或以上，一般可達到1010 PFU/ml以上，純化后可達1012 PFU/ml，且純化后的腺病毒可直接用于體內(nèi)注射，但免疫原性較高。我們需根據(jù)兩者特性綜合選擇。

如果我想在你們公司包病毒，需要提供什么？

（1）基因的ID和序列；

（2）所需要病毒的滴度及總量（我們有1×108 TU/ml及以上的各種規(guī)格供選擇），以及是否需要純化；

（3）（非必要）實驗?zāi)康募皽?zhǔn)備用病毒進行的下游實驗，這樣可以更方便我們根據(jù)您的需求制定方案。

多久能拿到LV？拿到后怎么保存？
一般情況，慢病毒包裝整個過程包括載體構(gòu)建（2~3周），病毒包裝+擴增（1~2周），檢測（約1~2周），順利的話4周左右可以拿到病毒，慢的話不會超過6周。

收到病毒后若要長期保存則需放入-80℃冰箱，可保存一年左右；若一周內(nèi)可以用完，則放入4℃冰箱即可。慢病毒應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，理論上每次凍融會讓病毒活性降低5~10%，因此對于凍融的病毒，使用前建議重新進行滴度檢測，或考慮分裝使用。

以上就是做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題及解答，希望對大家有所幫助。