復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科陳世益教授領導的研究團隊近日在生物材料領域頂尖期刊《Biomaterials》（IF = 10.317）上發(fā)表文章，證明了一種間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基在促進腱-骨愈合上具有積極作用。



肩袖撕裂是一種常見的運動損傷，威脅著專業(yè)運動員及廣大運動愛好者的健康。醫(yī)生大多采用肩袖修復術將撕裂的肌腱重新固定在骨表面。大多數(shù)患者能夠獲得良好的效果，但有些患者會發(fā)生再次撕裂。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是止點（enthesis）無法快速再生腱-骨界面的結(jié)構(gòu)。止點是肌腱或韌帶附著于骨頭的部位。

基于再生醫(yī)學的干細胞治療有望為肩袖損傷提供新的治療手段。人們已采用不同來源的間充質(zhì)干細胞（MSC）來促進腱-骨愈合，并在實驗中獲得了成功。然而，引入外源性材料也存在風險。植入的干細胞可能具有致瘤性，這限制了臨床應用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，真正有效的是干細胞的分泌組（secretome），而間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基包含了干細胞分泌的所有營養(yǎng)因子。

基于此，研究人員收集了人類骨髓來源干細胞的條件培養(yǎng)基（hBMSC-CM），并檢測了這種無細胞方法是否能夠在大鼠肩袖修復模型中促進腱-骨愈合。為了確保培養(yǎng)基在腱-骨界面處局部釋放，他們將小塊的海綿浸泡在培養(yǎng)基中，然后植入肩袖修復處。之后，他們利用相關細胞系在體外驗證了觀察到的結(jié)果，并在體內(nèi)進一步研究了hBMSC-CM介導的腱-骨愈合作用（圖1）。
 

圖1. 研究技術路線圖

hBMSC-CM促進了大鼠肩袖處的腱-骨愈合

研究人員首先利用賽業(yè)的間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)基，對間充質(zhì)細胞進行了鑒定。他們接著收集了間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基，測定了幾種生長因子的濃度。他們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中含有TGF-β、VEGF和IGF-1等能夠促進腱-骨愈合的生長因子。

之后，他們將海綿切成1mg的小塊，在滅菌后放入hBMSC-CM中浸泡30分鐘，并植入大鼠的肩袖修復處。術后4周和8周，他們通過組織學和放射學方法觀察到了再生的止點（圖2）。Micro-CT顯示，CM組修復區(qū)域的骨密度顯著高于DMEM對照組。

由于成纖維細胞是腱-骨止點重建的主要參與者，他們還檢測了腱-骨界面處的α-SMA連續(xù)表達。根據(jù)免疫組化染色分析，兩組患者主要在術后2周表達α-SMA。定量分析結(jié)果表明，CM組的陽性面積顯著高于DMEM組，表明CM組的重建過程更為活躍。這些結(jié)果顯示，hBMSC-CM可提高再生止點的質(zhì)量，促進腱-骨愈合。
 

圖2. 肩袖修復后再生止點的組織學和放射學分析

hBMSC-CM的積極作用與巨噬細胞有關

體內(nèi)實驗表明，海綿的完全降解期約為2周，與炎癥期重疊。在炎癥發(fā)生期間，巨噬細胞浸潤在腱-骨界面。于是，研究人員分析了hBMSC-CM是否在體內(nèi)和體外影響巨噬細胞的表型。免疫組化結(jié)果顯示，術后2周，CM組的CD86（M1表型標志物）水平顯著低于DMEM組，而CD163（M2表型標志物）水平顯著高于DMEM組，表明hBMSC-CM能夠抑制M1表型并促進M2表型（圖3）。

與表型變化一致，促炎細胞因子（TNF-α、IL-1α和 IL-1β）和抗炎細胞因子（TGF-β、IL-10和IL-13）的濃度也發(fā)生了變化。在LPS刺激后，促炎細胞因子的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著升高，而抗炎細胞因子的mRNA水平?jīng)]有顯著變化。不過，hBMSC-CM的干預下調(diào)了促炎細胞因子的水平，而增強了抗炎細胞因子的表達。
 

圖3. hBMSC-CM對巨噬細胞表型的影響

那么，hBMSC-CM對體內(nèi)腱-骨愈合的積極作用是否取決于巨噬細胞的存在？為了解答這個問題，研究人員使用了巨噬細胞清除（MC）大鼠，并觀察了hBMSC-CM對MC大鼠肩袖腱-骨愈合的影響。通過組織學和生物力學分析，他們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞清除可促進大鼠肩袖的腱-骨愈合，但在沒有巨噬細胞的情況下，hBMSC-CM失去了其優(yōu)勢，表明hBMSC-CM對腱-骨愈合的積極作用依賴于巨噬細胞。

hBMSC-CM通過Smad2/3通路
調(diào)控巨噬細胞的極化

最后，研究人員探索了hBMSC-CM調(diào)控巨噬細胞極化的機制。在LPS刺激后，hBMSC-CM能夠顯著升高Smad2/3的磷酸化水平，而抑制劑SB431542有效抑制了Smad2/3磷酸化。同時，SB431542顯著逆轉(zhuǎn)了hBMSC-CM對巨噬細胞極化的影響。當Smad2/3激活被SB431542阻斷后，hBMSC-CM對促炎細胞因子的抑制作用和對抗炎細胞因子的促進作用也被消除。這一現(xiàn)象表明，在炎性環(huán)境下，Smad2/3信號通路參與了hBMSC-CM對巨噬細胞極化的調(diào)控。

基于這些結(jié)果，研究人員認為hBMSC-CM通過促進巨噬細胞向M2表型極化并抑制M1表型，促進了大鼠模型肩袖處的腱-骨愈合。在hBMSC-CM的刺激下，成纖維細胞在腱-骨界面處積累，伴隨著纖維軟骨（fibrocartilage）的更早形成以及數(shù)量更多。再生的止點不僅更加有序，而且具有更好的生物力學性能（圖4）�？紤]到無細胞hBMSC-CM的安全性，研究人員認為它有望應用于臨床來促進腱-骨愈合。
 

圖4. 大鼠肩袖修復后的腱-骨愈合示意圖

原文檢索：
Chen W, Sun Y, Gu X, Cai J, Liu X, Zhang X, Chen J, Hao Y, Chen S. Conditioned medium of human bone marrow-derived stem cells promotes tendon-bone healing of the rotator cuff in a rat model. Biomaterials. 2021 Feb 11;271:120714. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120714. Epub ahead of print. PMID: 33610048.