MIQE指南中明確提出，進行qPCR實驗時必須測定以下檢測性能特點：PCR的效率、線性動態(tài)范圍、LOD和精密度。

1、PCR的效率：

強大和精確的qPCR測定通常具有高效率。在報告目的基因相對于參照基因的mRNA濃度時，PCR效率是非常重要的。ΔΔCq方法是測定樣本和用來標準化的單個參照基因之間濃度差異的最常見的方法之一。如果計算出目的基因與參照基因的Cq值的差異(ΔCq)，就可以將不同樣本的ΔCq值直接進行比較。值得注意的是，兩個基因的比較，必須在相似的擴增效率下進行。然而最常見的方法不一定是最合適的，相反已經開發(fā)了更為普通的定量模型用于校正擴增效率的差異^[1]和多個參照基因的使用^[2]。

PCR擴增效率必須通過校準曲線法建立，因為校準法簡單、快速、重現好，保證了PCR的平均反應效率、分析靈敏度和檢測方法的穩(wěn)健性。擴增效率，要通過校準曲線線性部分的斜率計算，具體計算公式為：PCR效率= 10^-1/slope-1，即以初始模板濃度的對數為X軸(自變量)，以Cq值為Y軸(因變量)作圖。理論上效率的最大值為1.00 (或100%)，此值表明每個循環(huán)周期的產物量加倍。理想情況下，所報道的平均PCR效率的CI (可信區(qū)間)或SE (誤差)值應該通過兩次校準曲線法得到。

發(fā)表文章時，除了要提交每個定量目標的校準曲線外，還要提供校準曲線的斜率和在Y軸上的截距。PCR效率的差異會產生不同斜率的校準曲線。隨著模板量的變化，目的基因和參照基因Cq值的差異并非固定不變，因此，按照固定Cq值計算得到的相對濃度是不準確的，可能會產生誤導結果。

大于40的Cq值是可疑的，由于其效率較低，建議不要報道。然而這種隨意設定Cq臨界值的做法是不科學的，因為這些值可能很低(可消除有效的結果)也可能很高(能增加假陽性結果)。

2、線性動態(tài)范圍：

PCR反應的動態(tài)范圍應該呈線性，即最高或最低的定量拷貝數應該通過平均校準曲線法得到，提交的文章應該包括線性動態(tài)范圍。校準曲線的產生依賴于所使用的模板，動態(tài)范圍應跨越至少3個數量級，最好擴大到5或6個1og₁₀濃度范圍。校準曲線的線性區(qū)間必須包括目標核酸的定量范圍。由于定量下限的界定往往很混亂，因此應該報告提交文章中所謂線性范圍內最低濃度處的變異。另外還必須報告線性相關系數( R2值)，并且最好提供整個線性動態(tài)范圍內的CI值。

3、檢測限：

檢測限定義為能夠檢測到95%的陽性標本的最低濃度。換言之，將濃度在LOD水平處的待測樣本進行多次重復測定，測得無效結果的概率小于5%。低拷貝PCR的出現是隨機有限的，而且不可能發(fā)生單次PCR的LOD值小于3個拷貝數的情況。然而，如果進行多次反應，則可通過數字PCR獲得低濃度范圍的準確定量。事實上，可將濃度校準品進行有限稀釋，并按照泊松分布計算PCR反應的失敗率和成功率。

4、精密度：

引起qPCR變異的因素很多，包括影響退火和變性的溫度差異、取樣誤差導致的濃度變異和隨機誤差。qPCR的精密度主要受濃度影響，并隨拷貝數增加而降低。最好進行多次重復測定，并將以SD誤差線形式表示的批內變異(重復性)和校準曲線的CI (可信區(qū)間)在圖中標示出來。變異系數CV不能用來描述Cq，但可用來表示拷貝數與濃度的變異。技術引起的變異應區(qū)別于生物學變異。生物學復制可直接導致組間或不同處理方法間qPCR結果的顯著性差異。對于診斷分析，還需要報告不同地點和不同操作者的批間精密度(重現性)。

資料來源：2020版MIQE指南

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參考文獻：

[1] Pfaffl M W . A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9):e45.

[2] Hellemans J ,  Mortier G ,  Paepe A D , et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data[J]. Genome Biology, 2007, 8(2).