銀鯧魚(yú)的種屬鑒定與定量研究
Species identification and quantfication of silver pomfret using the droplet digital PCR assay

 
背景
 
銀鯧魚(yú)（Pampus argenteus）是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的物種，中國(guó)有巨大的市場(chǎng)需求。近年來(lái)，由于高強(qiáng)度的捕撈，銀鯧魚(yú)的數(shù)量有所下降，為了維持利潤(rùn)，一些制造商已經(jīng)采取了用更便宜的魚(yú)代替銀鯧魚(yú)，進(jìn)行食品的造假、摻假。

目的

開(kāi)發(fā)一種準(zhǔn)確的方法來(lái)識(shí)別銀鯧魚(yú)食品，減少食品造假、摻假的非法行為。

實(shí)驗(yàn)材料

銀鯧魚(yú)和金鯧魚(yú)， 兩種魚(yú)按照比例分別為0.1%、0.5%、1%、10% 和50% 進(jìn)行混合， 即混合物中含有0.1g銀鯧魚(yú)/99.9g金鯧魚(yú)、0.5g銀鯧魚(yú)/99.5g金鯧魚(yú)、1g銀鯧魚(yú)/99g金鯧魚(yú)、10g銀鯧魚(yú)/90g金鯧魚(yú)，還有50克銀鯧魚(yú)/50克金鯧魚(yú)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

①篩選ddPCR引物和探針；
②特異性測(cè)試；
③引物和探針之間濃度比篩選；
④熔融溫度篩選；
⑤PCR循環(huán)數(shù)篩選；
⑥qPCR對(duì)比測(cè)試。

 
CY-1 細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ亞基（COI） CY-2 細(xì)胞色素B（cytb）
CY-3 16srrna
對(duì)三組引探進(jìn)行測(cè)試，CY-2、CY-3無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，故本實(shí)驗(yàn)采用CY-1組引探。
 
2，特異性測(cè)試

 
銀鯧魚(yú)液滴數(shù)字PCR檢測(cè)的特異性檢驗(yàn)。{ 樣品說(shuō)明如下： PC， 陽(yáng)性對(duì)照（ 銀鯧魚(yú)）；NC， 陰性對(duì)照（ 無(wú)菌蒸餾水）；1，卵狀細(xì)鱗鯛；2，無(wú)節(jié)圓鰓鯛；3，點(diǎn)狀圓鰓鯛；4，圓頭鯛；5，中國(guó)對(duì)蝦；6，灰鯛。
 
3，引物和探針之間濃度比篩選

不同的引物與探針濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，最終選取了300：200、300：300、400：200三種濃度比進(jìn)行下一步測(cè)試。
 
 
4，熔融溫度篩選

對(duì)實(shí)驗(yàn)③的三種不同濃度的探針進(jìn)行TM篩選，最終選定56℃、57℃、58.2℃三個(gè)溫度來(lái)進(jìn)行下一步測(cè)試。
 
 
5，PCR循環(huán)數(shù)篩選

對(duì)實(shí)驗(yàn)④的三個(gè)溫度進(jìn)行循環(huán)數(shù)篩選。
 

 

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