聽說隔壁實驗室買了一臺新成像，可以做Western Blot熒光掃描式Azure Sapphire成像，效果很好，操作也簡單，小師妹一臉羨慕，問了句，我從來沒做過熒光實驗，現(xiàn)在期刊雜志要求也在升級，也建議使用熒光的方法，之前因為沒有合適的儀器，所以不能嘗試，現(xiàn)在可以準(zhǔn)備我的實驗了，那從化學(xué)到熒光Western Blot實驗，有哪些注意事項，或者哪些不同呢？

Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)

實驗室大師兄這時候走過來，聽聽師兄給你的建議，以后要多看書，知道嗎？

一、增加濃度

與化學(xué)發(fā)光Western Blot相比，所需的一抗和二抗的濃度可能會增加，這也取決于您使用的成像儀系統(tǒng)。在激光成像器中，這種影響可能不太明顯。

二、首先進(jìn)行單色實驗測試

首先單獨測試您的抗體非常有意義。這樣，您可以確定最佳濃度，在簡單的環(huán)境中可以把背景或非特異性的因素考慮進(jìn)去，而不是一次性分析3種不同的一抗和二抗。

三、使用吸附性二抗

雖然聽起來很簡單，但許多人并不考慮，他們將多種抗體、多個物種加入到單一的印跡中。如果您在其他研究領(lǐng)域使用多重?zé)晒�，您可能已�?jīng)意識到二抗的交叉吸附，減少物種間交叉反應(yīng)性的重要性。但在Western中，很多人并不考慮，這是值得檢查的，以確保他們達(dá)到要求。

四、擴(kuò)展光譜

三色Western Blot是令人興奮，那五種顏色呢？可以大大增加對不同波峰的區(qū)分。顯然，這可能需要一些工作進(jìn)行抗體優(yōu)化，一次用于5個蛋白的檢測可以節(jié)省時間和成本花費(fèi)。

五、檢查印跡膜

盡管越來越多的熒光印跡膜正在開發(fā)中，但一些膜在UV光源暴露下發(fā)出自發(fā)熒光產(chǎn)生高背景信號。為了增加靈敏度，我們建議在做熒光Western Blot時使用低熒光的PVDF膜代替NC膜。

六、為蛋白選擇合適的通道

對于標(biāo)準(zhǔn)熒光，高豐度蛋白使用藍(lán)色通道進(jìn)行檢測，中等豐度和低豐度蛋白分別使用綠色和紅色通道檢測。此外，使用激光NIR，可獲得極好的靈敏度和低背景，也是低豐度蛋白檢測的理想選擇。

哇塞，師兄好厲害哈，比心心，我要去準(zhǔn)備實驗去了，師兄暗自竊喜，我剛在隔壁聽完Azure工程師的培訓(xùn)，這不就用上了。
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