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實(shí)驗(yàn)汪們可要抓緊搬磚咯

前面三份筆記
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以下，可都是尖貨兒喲！

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Part 1

 —— 前 言 | 

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ELISA方法用于雜交瘤和噬菌體展示篩選是最為廣泛的高通量的抗體發(fā)現(xiàn)的篩選方法，其實(shí)質(zhì)是親和力測定方法的一種變種，其目的是需要建立ELISA信號(hào)值和樣品親和力大小之間的正相關(guān)性。

相對于采用ELISA進(jìn)行抗體的親和力測定方法，用于雜交瘤和噬菌體展示篩選的ELISA方法有以下難點(diǎn)：
1.待測樣本極具多樣性，且單一樣品通常也是混合物，有很大的可能存在非特異吸附；
2. 不同的待測樣品之間可能存在較大的濃度差異，濃度的大小和親和力的大小均會(huì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

在進(jìn)行雜交瘤和噬菌體展示篩選方法開發(fā)時(shí)，需要選擇合適的條件使信號(hào)值主要能夠表征親和力的大小而一定程度上忽略濃度差異造成的影響。

本文是ELISA定量測定方法開發(fā)和親和力測定方法開發(fā)的進(jìn)階版本，配體受體反應(yīng)的基本原理解析，和兩種應(yīng)用的差異性區(qū)分是進(jìn)行ELISA篩選方法的開發(fā)
的基礎(chǔ)。
   - 原理解析 - 
 ELISA信號(hào)值和親和力大小的關(guān)系 

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無論是進(jìn)行雜交瘤的篩選還是噬菌體展示的篩選，其化學(xué)原理的實(shí)質(zhì)是抗體和抗原可逆的相互作用，John McCafferty在Phage Display of Peptides and Proteins A Laboratory Manual一書的第七章節(jié)Phage Display：

Factors Affecting Panning Efficiency中對可逆反應(yīng)的數(shù)學(xué)原理有過理論的推導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，簡而概之可以用下面的公式進(jìn)行描述：
Abinput代表可逆反應(yīng)中抗體的加入量，Aginput 代表可逆反應(yīng)中抗原的加入量，Kd代表Ab和Ag的親和力大小。

由公式可知，當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，形成的抗原抗體偶聯(lián)物占抗體的加入量的比值（proportion bound），是一個(gè)與抗原的加入量和親和力大小這兩個(gè)參數(shù)相關(guān)的特征函數(shù)。具體在ELISA測定過程中當(dāng)抗體的加入量是恒定值時(shí)，proportion bound可以用檢測的信號(hào)值來等價(jià)表示，在ELISA反應(yīng)中抗原的加入量和Kd將決定信號(hào)的大小。

相同濃度的抗體，因?yàn)橛H和力不一樣，在同一抗原濃度下其proportion bound的比例也不一樣，用具體的圖形演示如下圖：

紅色實(shí)線是親和力為1nM的抗體Ab1隨抗原濃度變化其proportion bound的函數(shù)曲線，藍(lán)色實(shí)線是親和力為10nM的抗體Ab2隨抗原濃度變化其proportion bound的函數(shù)曲線，綠色虛線為在相同抗原濃度下，Ab1/ Ab2 proportion bound的比值。

在抗原濃度為10nM的條件下，90%的Ab1(Kd=1nM)和50%的Ab2(Kd=10nM)能夠形成抗體抗原偶聯(lián)物，作為ELISA檢測的信號(hào)值，Ab1，Ab2親和力10倍的差異反應(yīng)到ELISA信號(hào)值上1.8倍的信號(hào)差異；在抗原濃度為1nM的條件下，50%的Ab1(Kd=1nM)和9.1%的Ab2(Kd=10nM)能夠形成抗體抗原偶聯(lián)物，作為ELISA檢測的信號(hào)值，Ab1，Ab2親和力10倍的差異反應(yīng)到ELISA信號(hào)值上5.5倍的信號(hào)差異；在加入的抗體濃度是相同的情況下，加入反應(yīng)的抗原的濃度越少，ELISA信號(hào)比值的差異和抗體親和力比值的差異更具相關(guān)性。

抗原的濃度決定了ELISA篩選方法的選擇性！

以上是關(guān)于雜交瘤和噬菌體展示篩選理論狀態(tài)的推導(dǎo)，也是ELISA篩選結(jié)果出來了做出客觀解讀的理論依據(jù)，在實(shí)際的篩選應(yīng)用過程中由于不同的待測抗體樣品之間可能存在較大的濃度差異。

在抗原濃度較高的情況下ELISA信號(hào)差異很多情況下由于抗體樣品的濃度差異導(dǎo)致的，ELISA信號(hào)值對于親和力大小不具有選擇性；只有在抗原濃度較低時(shí)，信號(hào)值主要能夠表征抗體親和力的大小而一定程度上忽略濃度差異造成的影響，而在ELISA方法開發(fā)時(shí)當(dāng)抗原濃度較低時(shí)，相對于抗原濃度較高時(shí)，其ELISA信號(hào)值要弱很多，提升ELISA方法信號(hào)的靈敏度，如何通過優(yōu)化酶聯(lián)抗體的濃度，挑選顯色液和選擇顯色時(shí)間以增強(qiáng)ELISA檢測的信號(hào)值是一個(gè)有區(qū)分度的ELISA篩選方法的關(guān)鍵。

當(dāng)ELISA檢測的信號(hào)值得到提升時(shí)，由于篩選樣品復(fù)雜性，往往其背景信號(hào)也會(huì)極大的提升，如何通過封閉液，酶標(biāo)板材等降低背景信號(hào)值，得到好的信噪比是一個(gè)高質(zhì)量的ELISA篩選方法的另一個(gè)關(guān)鍵。

Part 3

 - 實(shí)例分享 -  ELISA用于噬菌體展示篩選 

布 局——

(Note 1)

一 般 操 作 流 程

1.酶標(biāo)板的制備
取濃度為100 ug/ml抗原，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標(biāo)板條中 (Note 2)，其中加入包被液做包被抗體的空白對照，2-8℃過夜。

2.用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 3)室溫封閉1小時(shí)；洗滌液洗板3次，拍干待用；

3.取出包含有陰性對照和陽性對照過夜孵育制備含有噬菌體的深孔96孔板，在奧豪斯高速離心機(jī)中2000g離心15min，取上清，稀釋10倍，一一對應(yīng)加入包被好酶標(biāo)板中。(Note 4)

4.放入奧豪斯微孔板振蕩器內(nèi) (如ISLDMPHDG- 30391935)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；    

5.用洗滌液洗板3次，拍干；

6.抗M13 p8酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 5），在漩渦混合器上（如VXMNFS-30392112）混勻，100ul/孔。

7.放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)； 

8.用洗滌液洗板4次，拍干；

9.取酶聯(lián)抗體對應(yīng)的TMB顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；（Note 6）

10.使用8道排槍以100 ml/孔加入TMB顯色液；

11.顯色液室溫避光放置10-30分鐘 （Note 7）；

12.使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應(yīng)；

13.用酶標(biāo)儀測定信號(hào)值；

14.結(jié)果分析（Note 8）。

Note1：由于不同的噬菌體樣品有不同的親疏水性，其對酶標(biāo)板材的非特異吸附強(qiáng)度不一樣，做一塊沒有抗原包被的陰性對照板是十分有必要的。

Positive和Negtive是和樣品有同樣噬菌體制備過程，Positive Stock為早已經(jīng)制備好的分裝保存的陽性噬菌體，前者目的是監(jiān)控在不同時(shí)間內(nèi)噬菌體樣品制備過程的差異，后者是監(jiān)控在不同時(shí)間內(nèi)ELISA檢測操作的差異。

Note2：在包被過程中，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,這樣可以極大的減少背景信號(hào)值，提高整個(gè)方法的信噪比。

在實(shí)驗(yàn)初期包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，然后根據(jù)不同包被條件下同一樣品信號(hào)大小來進(jìn)行判斷優(yōu)化。

一個(gè)已知親和力的展示陽性抗體的噬菌體是十分有必要的，根據(jù)該陽性展示噬菌體樣品的信號(hào)值來確定最終篩選過程中抗原的包被濃度。

抗原直接包被酶標(biāo)板材上會(huì)屏蔽部分結(jié)合位點(diǎn)，造成部分假陰性的結(jié)果，如果條件允許可采用生物素化抗原，首先5ug/ml的鏈霉親和素包板，然后加入0.05-0.2 ug/ml不等的生物素化抗原。抗原直接包被和間接包被其效率不太一樣，采用間接包被可適當(dāng)降低生物素化抗原的包被濃度。

Note3：在有生物素化抗原參與的ELISA實(shí)驗(yàn)中，不要加入含脫脂奶粉的封閉劑，脫脂奶粉含有微量生物素，會(huì)干擾整個(gè)檢測體系。

Note4：噬菌體上清液的稀釋比例，可提前根據(jù)陽性噬菌體樣品做好稀釋預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

Note5：應(yīng)選擇抗噬菌體的P8蛋白的酶聯(lián)抗體，噬菌體有2000個(gè)以上的P8蛋白，適當(dāng)?shù)脑黾用嘎?lián)抗體的濃度可以提高方法的靈敏程度，筆者曾增加5倍的酶聯(lián)濃度得到了3倍的信號(hào)提升。

Note 6：市面上TMB底物最低和最高有10倍的顯色差異，建議選擇市面上最強(qiáng)的TMB顯色底物。

需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號(hào)線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，信號(hào)值超過3時(shí)，信號(hào)和親和力的相關(guān)性變差。

Note 7：顯色時(shí)間可適當(dāng)?shù)难娱L，一般來說在30分中內(nèi)顯色的信號(hào)值和顯色的時(shí)間成線性。

Note 8：條件的選擇最終是通過陽性噬菌體的信號(hào)值決定的，陽性噬菌體的親和力大小是一個(gè)非常重要的選擇參數(shù)。

如陽性噬菌體的親和力為1nM時(shí)，篩選的目的是得到高親和力的抗體，可以選擇陽性噬菌體的信號(hào)在OD值為0.5時(shí)的條件作為最終的篩選條件，這樣很多OD值很小的低親和力的抗體均被過濾掉；篩選的目的是盡可能得到多的親和力抗體，可以選擇陽性噬菌體的信號(hào)在OD值為2-3時(shí)的條件作為最終的篩選條件，低親和力的抗體在OD值上也不會(huì)太小，可以得到體現(xiàn)。

不論如何抗原的濃度大小決定了選擇性，選擇較小的抗原濃度進(jìn)行反應(yīng)是信號(hào)和親和力大小匹配的關(guān)鍵和趨勢性選擇，信號(hào)大小的調(diào)節(jié)可以通過酶聯(lián)抗體濃度，高顯色能力的顯色液和顯色時(shí)間進(jìn)行調(diào)節(jié)。

如果在一塊板的檢測中未知樣品的信號(hào)值大小呈合理的分布是ELISA條件較好的表現(xiàn)。

Part 4

 - 總結(jié) -  

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ELISA用于雜交瘤和噬菌體展示篩選是ELISA用于親和力測定方法的一種變種，想要得到好的信號(hào)和親和力大小的相關(guān)性，低抗原濃度條件下進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)是必須的。

低抗原濃度條件下會(huì)有低的信號(hào)值，通過增加酶聯(lián)抗體濃度，選擇高顯色能力的顯色液和延長顯色時(shí)間，增加ELISA靈敏程度是ELISA優(yōu)化的技術(shù)方向。

由于檢測樣品的多樣性和復(fù)雜性，高靈敏的ELISA檢測體系必然會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)的增加，無法得到很好的信噪比，疏水性的酶標(biāo)板條，盡可能低的樣品的稀釋倍數(shù)是解決這個(gè)問題的關(guān)鍵。

一個(gè)穩(wěn)健的能用于雜交瘤和噬菌體展示篩選方法是ELISA各種耗材，試劑和實(shí)驗(yàn)條件的完美組合，需要對試劑耗材的多種可能進(jìn)行探索，也是平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)的系統(tǒng)匯總，以下是用于篩選方法的優(yōu)化方向的匯總。
 

以上，就是小奧帶給大家的
第四篇ELISA方法學(xué)開發(fā)的干貨內(nèi)容！
我們下期再見哦！
 

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