近年來，生物藥的市場需求逐年擴容，其中抗體藥物因其靶向性好，治療效果顯著，在生物藥中占據著舉足輕重的地位，目前已經進入了抗體藥物發(fā)展的黃金時代。隨著抗體藥的需求越來越大，抗體篩選技術的發(fā)展也是日新月異，目前應用較普遍的有雜交瘤技術、抗體文庫篩選技術、納米抗體技術和轉基因小鼠抗體篩選技術。其中抗體文庫篩選又分為噬菌體展示篩選技術、酵母表面展示技術、核糖體展示技術和mRNA展示篩選技術。接下來，小編帶大家一起來了解一下這些抗體篩選技術。

雜交瘤技術制備單克隆抗體

 

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診斷、預防和治療提供了新的方法。單克隆抗體，是由單一B細胞產生的高度均一、識別特定抗原表位的抗體。

 

Fig1 單克隆抗體制備^[1]

 

許多治療性單克隆抗體已廣泛用于腫瘤、自身免疫和感染等疾病的治療^[2]，單克隆抗體在臨床疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，其主要的作用機理如圖2所示^[3]，基于單克隆抗體的抗體藥是目前治療多種疾病的有效方法。

 

 

Fig2 單克隆抗體的分類及作用機理

 

噬菌體展示篩選技術

 

2018年10月3日George Smith教授因其在噬菌體展示相關研究方面的貢獻獲得了諾貝爾化學獎，近年來，噬菌體展示技術正被廣泛用于抗體藥物的研發(fā)，已有大量的上市藥物被批準使用，其原理為將B淋巴細胞的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）采用PCR方法進行擴增，將擴增的片段插入到噬菌體載體中，抗體分子Fab片段或者單鏈抗體（scFv）與單鏈噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，再將噬菌體轉染至宿主細胞中進行增殖，待成熟后釋放出來，最后利用抗原篩選的方法經過親和吸附-洗脫-擴增等步驟后即可獲得靶抗原特異性的單克隆噬菌體抗體^[4]。

 

 

Fig3 噬菌體展示技術

 

酵母表面展示技術

 

酵母表面展示技術原理為將外源蛋白基因與特定的載體基因融合后導入酵母細胞，融合蛋白含有可錨定在酵母細胞壁上的結構，經轉錄翻譯后可將外源蛋白固定化表達在酵母細胞表面，圖4顯示為采用酵母細胞表面展示技術結合流式細胞術篩選抗體。酵母表面展示技術作為真核展示系統(tǒng)，已逐漸成為現代生命科學領域一種十分有效的展示技術，在許多方面得到了廣泛的應用^[5]。

 

Fig4酵母細胞表面展示技術^[6]

 

核糖體展示與mRNA展示篩選技術

 

1997年，Pluckthun實驗室建立了體外篩選完整功能蛋白的新技術-核糖體展示技術，其主要流程為，首先構建核糖體展示的DNA模板，然后依次體外轉錄、體外翻譯和親和篩選。轉錄產物mRNA不含任何終止密碼，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'末端，使目的基因的翻譯產物展示在核糖體表面，并形成mRNA-蛋白質-核糖體”三元復合體, 采用洗脫緩沖液使核糖體解離，釋放mRNA，后者經過純化后用作RT-PCR的模板，重新引入核糖體展示的各種必需元件、進行下一循環(huán)的富集和選擇，最終篩選出高親和力的目標分子^[7]。核糖體展示技術在細胞外進行，可獲得大容量庫（10¹¹-10¹³），篩選周期短，操作簡單，結合體外突變技術可篩選出新功能的高活性蛋白^[8]。

mRNA展示技術又稱mRNA-蛋白質融合體展示技術，是一種新興的體外多肽篩選技術，其與核糖體展示技術原理類似，小編這里就不作贅述了。目前，mRNA展示技術已經相當成熟，成為體外蛋白質篩選和定向進化的有力工具，在生物技術、醫(yī)藥衛(wèi)生和蛋白質組學等多個方面有很好的應用前景。

 

 

Fig5 核糖體展示篩選技術^[9]

 

納米抗體（Nanobody, Nb）篩選方法

 

納米抗體的制備是從駱駝體內分離出重鏈抗體(Heavy chain antibodies , HCAbs)。提取總RNA經反轉錄獲得模板，根據重鏈抗體保守區(qū)域設計引物，經PCR法擴增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)基因(Viriable domain ofheavy chain of heavy-chain antibody, VHH)，而后將其克隆至載體，體外表達獲得含有多種單價 Nb的抗體庫。應用特定抗原從Nb庫中經過多次淘選即可得到抗原特異性的Nb。Nb庫的構建較為簡單、有效、僅用一對簡并引物擴增就可以獲得駱駝重鏈抗體的全套VHH基因，經過3-4輪富集篩選后即可分析單個克隆以獲得目的抗體。Nb源于天然缺失輕鏈的重鏈抗體，天然存在，穩(wěn)定性和可溶性更強；且具有很強的抗原結合能力，特異性較強^[10]。

 

 

Fig6 納米抗體篩選方法

 

轉基因小鼠全人源抗體篩選技術

 

20世紀90年代中期以后，利用人抗體轉基因小鼠平臺技術和抗體庫平臺技術開發(fā)的全人源抗體逐漸占據了抗體藥物研發(fā)的主導地位，使抗體工程技術進入了一個新的發(fā)展階段-全人源抗體階段。轉基因小鼠制備全人源抗體的實驗原理是:采用基因編輯技術將小鼠Ig基因替換為人Ig基因，然后用抗原免疫小鼠，再經雜交瘤技術即可大量生產人源化抗體。轉基因小鼠技術平臺已經成功地作為一個創(chuàng)新全人源單抗藥物以及常用靶點升級抗體藥物的來源。轉基因小鼠的研發(fā)周期長，風險高，但其對抗體藥物篩選的意義是巨大的，因此對其進行深入研究是非常有前景的，同時也是必要的^[11]。

好了，小編就給大家介紹到這里了，如果有興趣，歡迎與我們共同探討。

依托于基因編輯，海門動物中心和藥理藥效服務平臺，百奧賽圖于2016年正式成立新藥研發(fā)服務平臺，同時，通過將小鼠重鏈和k輕鏈基因原位置換為人抗體基因（Mb級），百奧賽圖于2019年初成功制備了全新小鼠研究模型-RenMab Mouse，通過它，我們可以直接在小鼠體內產生全人單克隆抗體，大大節(jié)省了鼠源抗體的改造時間，如有興趣，歡迎隨時咨詢偶~

參考資料

[1]http://www.biomart.cn/specials/cloudclone2017/article/534453

[2]Reichert JM. Antibodies to watch in 2017[J]. MAbs，2017，9: 167–181. 

[3]趙晨曦，胡卓偉，崔冰. 單克隆抗體藥物研究進展[J]. 藥學學報，2017(06):5-15.

[4]https://www.nobelprize.org/uploads/2018/10/popular-chemistryprize2018.pdf

[5]王佳堃，孫中遠，劉建新.酵母細胞表面展示技術[J].動物營養(yǎng)學報，2011，23(11):1847-1853.

[6]Methods Mol Biol. 2015; 1319: 155–175.

[7]https://wenku.baidu.com/view/8076684aa8956bec0975e39d.htmlrec_flag=default&sxts=1568164978537

[8]https://wenku.baidu.com/view/ff8ac80ea6c30c2259019ea0.html

[9]郭園. 核糖體展示研究進展[J]. 生物技術通報，2016，32(8): 22-27

[10]https://www.docin.com/p-1515704780.html

[11]http://www.doc88.com/p-9743589141678.html
 

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