DNA測序基本原理及流程
1977年，Sanger等人發(fā)展建立起來的一種DNA測序方法。
基本原理：
雙脫氧鏈末端終止法
雙脫氧鏈末端終止法通過使用鏈終止劑—類似于正常dNTP的2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，將延伸的DNA鏈特異性地終止。其反應(yīng)體系也包括單鏈模板、引物、4種dNTP和DNA聚合酶。共分四組，每組按一定比例加入一種 (ddNTP)，它能隨機(jī)滲入合成的DNA鏈，一旦滲入合成即終止，于是各種不同大小片段的末端核苷酸必定為該種核苷酸，可以從放射自顯影帶上直接閱讀DNA的核苷酸序列。
 
雙脫氧鏈末端終止法不僅具有化學(xué)測序法的優(yōu)點，而且更適用于大規(guī)模的測序。但它要求有一個純凈的單鏈DNA模板和一個合成反應(yīng)所需的特異性的引物。因此，早期的工作僅局限于單鏈?zhǔn)删�體為模板，若干個不同的特定限制性內(nèi)切酶酶解片段為引物，在模板鏈的不同部位引導(dǎo)合成，從而確定出噬菌體DNA的核酸序列。然而，對于大量存在著的天然雙鏈DNA分子，因沒有良好的制備產(chǎn)量和質(zhì)量高的分離鏈的技術(shù)，而限制了雙脫氧鏈末端終止法的應(yīng)用程度。
經(jīng)典的雙脫氧鏈末端終止法測序技術(shù)的改進(jìn)
標(biāo)記物方面的改進(jìn)： 由于放射性同位素對人體的危害，許多實驗室開始利用非放射性物質(zhì)來取代放射性同位素。如生物素、地高辛、銀染法、熒光標(biāo)記物等化學(xué)發(fā)光物生物素、地高辛、銀染法、熒光標(biāo)記物等化學(xué)發(fā)光物 。在雙脫氧法測序時，它們作為標(biāo)記物，示蹤測序反應(yīng)的產(chǎn)物，最后通過酶顯色反應(yīng)或者熒光信號顯示出測序的結(jié)果。這些方法比傳統(tǒng)的放射性同位素方法檢測容易、安全、快速、費用也低。
經(jīng)典的雙脫氧鏈末端終止法測序技術(shù)的改進(jìn)
電泳方法的改進(jìn) : 電泳方法的改進(jìn)主要采用毛細(xì)管電泳法。 毛細(xì)管電泳是被分離物質(zhì)在毛細(xì)管中的電泳。1992年，Matnies等首先提出陳列毛細(xì)管電泳法，采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置。25只毛細(xì)管并列電泳，每只毛細(xì)管在1.5小時內(nèi)可讀出350bp。DNA序列分析效率可達(dá)6000bp/h。
測序過程: DNA Sequencing with GenomeLab TM
⒈分離純化模板DNA
⒉DNA模板定量分析
⒊測序反應(yīng)
⒋測序反應(yīng)后純化
⒌On-line變性
⒍毛細(xì)管電泳和檢測
⒎數(shù)據(jù)分析
分離純化模板DNA
⒈應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒或者切膠純化的方法得到相應(yīng)的質(zhì)粒模板或者PCR產(chǎn)物；
⒉將DNA儲存在滅菌水里如ddH2O, 18.2MH2O超純水；
注意：不要使用 DEPC 處理的水，水中不能有EDTA ，否則將抑制測序反應(yīng)
⒊通過紫外分光光度計定量DNA模板，DNA模板的濃度應(yīng)該> 0.1ug/ul；
⒋通過瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA模板的質(zhì)量。
測序反應(yīng)后純化
去掉反應(yīng)產(chǎn)物中的dNTP,ddNTP 和鹽分
乙醇沉淀 ( 利用96 孔板離心機(jī)）
 測序反應(yīng)后純化
純化得到 DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物
 DNA測序儀檢測
熒光標(biāo)記的DNA鏈按從小到大的順序被毛細(xì)管電泳分離。
 激光誘導(dǎo)的熒光終止劑被檢測器識別，直接閱讀DNA的核苷酸序列
 Typical Sequencing Result
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