一、核酸提取技術(shù)的改進(jìn)

        中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) 進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提是取得高數(shù)量和高質(zhì)量的核酸，即DNA和RNA。由于隱球菌細(xì)胞壁外有一層厚厚的莢膜，為破除真菌細(xì)胞壁造成很大困難。可靠地提取隱球菌DNA的方法建立于20世紀(jì)80年代后期，研究者先后建立了玻璃珠方法、超聲粉碎、液氮冷凍研磨等破壁技術(shù)。后來(lái)，發(fā)展酶學(xué)方法取代物理方法，用生物酶消化莢膜和細(xì)胞壁、制備原生質(zhì)體，然后再用去污劑溶解細(xì)胞膜、釋放DNA。目前常用的酶為Novozyme234，具有1，3-a-及1，3-b-萄聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、地衣酶、木聚糖酶等多種活性，破壁效果好。另外新生隱球菌能夠產(chǎn)生細(xì)胞外DNA酶，在反應(yīng)體系中始終保持高濃度的EDTA，可以有效地抑制DNA酶，防止DNA被降解。

二、基因克隆

已掌握的新生隱球菌的遺傳圖譜相當(dāng)少，而且也相當(dāng)不精確。目前還沒(méi)有完成新生隱球菌全基因組的序列測(cè)定，只確定和報(bào)道了少數(shù)基因在染色體上的定位。

1、毒性基因
新生隱球菌的主要致病因素有四個(gè)：多糖莢膜、產(chǎn)黒色素、a接合型和37℃能存活。Still和Chang等應(yīng)用經(jīng)典的遺傳學(xué)方法和基因互補(bǔ)技術(shù)分離，并鑒定了參于莢膜形成的基因----CAP59, 該基因編碼458個(gè)氨基酸，含有6個(gè)內(nèi)含子，經(jīng)雜交分析確定CAP59基因定位于新生隱球菌的染色體Ⅰ上。二個(gè)克隆的莢膜形成必需基因----CAP64，其DNA全長(zhǎng)1.9kb，預(yù)計(jì)編碼522個(gè)氨基酸，有8個(gè)內(nèi)含子，定位于染色體Ⅲ上。新生隱球菌的產(chǎn)黒素基因----CNLAC1也已克隆，該基因編碼642個(gè)氨基酸，含14個(gè)內(nèi)含子。a-接合型和a-接合型是一對(duì)等位基因，與新生隱球菌的性生殖有關(guān)，遺傳公析顯示a-接合型和菌株毒性增加存在關(guān)聯(lián)，Moore等應(yīng)用差異克隆技術(shù)獲得了a-接合型相關(guān)基因----MFa,內(nèi)含一個(gè)零擁有114bp的開(kāi)放閱讀框架（ORF)。

2、結(jié)構(gòu)基因
Edman等應(yīng)用大腸桿菌互補(bǔ)技術(shù)克隆了編碼新生隱球菌乳清酸核苷-單磷酸-焦磷酸化酶（OMPase）的基因----URA5，該基因包括675個(gè)核苷酸和2個(gè)內(nèi)含子，定位于1500kb左右的染色體上。Varma等經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)URA5陰性突變株其毒性明顯降低，可見(jiàn)URA5基因與新生隱球菌的致病能力有關(guān)。Edman等隨后克隆了編碼新生隱球菌磷酸核糖胺咪唑羧化酶的基因----ADE2，磷酸核糖胺咪唑羧化酶參于嘌呤的生物合成，而在許多微生物中嘌呤代謝和菌株致病性間存在強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)。ADE2基因有望成為探索抗真菌治療的一個(gè)突破口。胸苷酸合成酶催化還原性甲基化反應(yīng)，在DNA生物合成中起關(guān)鍵作用。Livi等應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了編碼新生隱球菌胸苷酸合成酶的基因----CnTS，并測(cè)到了基因序列，克隆的CnTS基因長(zhǎng)1127kp，有3個(gè)內(nèi)含子和1個(gè)951bp的ORF,編碼一分子量為35844Da的蛋白質(zhì)。rRNA是生物進(jìn)化的高度保守基因，編碼新生隱球菌4種rRNA分子即5.8s、18s、25s和5s rRNA的基因均已得到克隆，它們?cè)?rRNA基因簇中的排列次序也已確定，即為5s-18s-5.8s-25s。Fan等認(rèn)為rRNA各亞基在兩個(gè)變種中順序一致，且5s rRNA的大小均為118堿基。Perfect等對(duì)新生隱球菌的rRNA基因進(jìn)行染色體定位，發(fā)現(xiàn)不同株隱球菌的rRNA基因定位于不同大小的染色體，其分布范圍從大于1130kb到小于2000kb。

3、調(diào)控基因
為了仔細(xì)分析CAP59基因的功能區(qū)，Chang等將CAP59基因置于隱球菌GAL7啟動(dòng)子（pGAL7）控制之下，在數(shù)個(gè)組成不同的GAL7:CAP59融合基因中，只有一個(gè)含有完全CAP開(kāi)放閱讀框架的基因能在半乳糖誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化無(wú)莢膜突變株，形成莢膜。這說(shuō)明整個(gè)開(kāi)放閱讀框架是CAP59編碼蛋白質(zhì)所必需的。為了研究新生隱球菌肌動(dòng)蛋白基因的調(diào)控機(jī)理，Toffalettit等將新生隱球菌肌動(dòng)蛋白基因（ACT）的啟動(dòng)子和大腸桿菌（E.coli）的報(bào)告基因----b-半乳糖苷酶基因（LACZ）融合起來(lái)，構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒----ACTp:LACZ，通過(guò)在體外檢測(cè)b-半乳糖苷酶的活性來(lái)判斷肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的功能。結(jié)果，重組子表達(dá)b-半乳糖苷酶的活性，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和在隱定生長(zhǎng)期是有差別的，又都表現(xiàn)出溫度信賴(lài)性，即在37℃培養(yǎng)條件下比在30℃培養(yǎng)條件下在更高的表達(dá)活性。提示隱球菌肌動(dòng)蛋白基因受溫度調(diào)控，同時(shí)作者推測(cè)還有其它隱球菌基因也受溫度調(diào)控，這就解釋了為什么“37℃能存活”成為隱球菌致病因素之一。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真菌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)不同于哺乳動(dòng)物或植物，但Zhang等在研究新生隱球菌毒性基因----CNLAC1的同時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)它的調(diào)控機(jī)理非常相似于哺乳動(dòng)物或植物，即通過(guò)阻斷轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游區(qū)域多個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)和利用富含谷氨酸的增強(qiáng)子（如Sp1）來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的目的。

三、分子流行病學(xué)

對(duì)于感染性疾病來(lái)說(shuō)，流行病學(xué)資料是非常重要的。它是確定感染源和傳播途徑的重要基礎(chǔ)，也是制定群體預(yù)防措施的重要依據(jù)。早在20世紀(jì)80年代末和90年代初，就已應(yīng)用分子技術(shù)對(duì)新生隱球菌進(jìn)行分型研究。這些分子流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)方法包括：多位點(diǎn)酶電泳分型、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳核型分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（RFLPs）DNA指紋圖譜、線粒體DNA探針和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RFPD）等。
盡管在體外培養(yǎng)時(shí)，臨床分離株和環(huán)境分離株的帶型是相對(duì)隱定的，但新生隱球菌在一定的環(huán)境壓力下還是表現(xiàn)出遺傳的多態(tài)性。某些菌株的基因型與生俱來(lái)就不如其他菌株隱定。這種快速變化的遺傳多態(tài)性，在微衛(wèi)星水平和大片段DNA水平（染色體）都有所表現(xiàn)。因此在使用非常敏感的基因分型方法時(shí)，需要考慮新生隱球菌在一定的環(huán)境和宿主壓力下微進(jìn)化的現(xiàn)象。

RAPD分析是一種利用隨機(jī)合成的單個(gè)寡核苷酸引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，分析DNA片段大小和數(shù)量多態(tài)性，從而比較靶基因差異的一種技術(shù)。RAPD自1990年問(wèn)世以來(lái)，已陸續(xù)用于酵母菌和絲狀真菌的定型、分類(lèi)和流行病學(xué)研究。這一方法適用于真菌各秩級(jí)的分類(lèi)學(xué)研究，因?yàn)檎婢�基因組龐大，RAPD能對(duì)整個(gè)基因組序列做大致的分析，特別適用于分子生物學(xué)研究甚少、不了解基因組DNA序列的真菌。它借用的基本方法是PCR技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、迅速，便于大規(guī)模使用。

Meyer等用（GTG）5、（GACA）4和噬菌體M13編碼順序（GAGGTGCGGCTCT）作為RAPD的隨機(jī)單引物，對(duì)42株新生隱球菌進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)志（亦稱(chēng)PCR指紋）具有高度重復(fù)性，且在種、變種和單個(gè)菌株水平上存在差異。新生隱球菌新生變種的A、D血清型的指紋截然不同，而格特變種的B、C血清型其指紋則不易區(qū)分。格特變種的兩種血清型比新生變種的兩種血清型在遺傳學(xué)上更為同源。溫海等用（GTG）5、（GACA）4和（GATA）4為引物，PCR擴(kuò)增30株來(lái)自意大利米蘭的新生隱球菌臨床分離株和野生株、12株來(lái)自中國(guó)上海的臨床分離株標(biāo)準(zhǔn)株。結(jié)果能清晰地區(qū)分隱球菌的不同種、不同血清型及相同血清型的不同株，與Meyer的報(bào)告相似。顧菊林等以（GACA）4作為RAPD的隨機(jī)單引物，分析了11株新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株和14株新生隱球菌臨床分離株，結(jié)果顯示（GACA）4引物產(chǎn)生的PCR指紋在新生隱球菌的種、血清型和株水平上呈現(xiàn)明顯特征性差異。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)1例隱球菌復(fù)發(fā)病例，其初始分離株和復(fù)發(fā)分離株其PCR指紋相同，說(shuō)明為同一菌株，提示隱球菌的復(fù)發(fā)是原始菌株的復(fù)燃所致，而不是新菌株的感染所為。作者認(rèn)為RAPD分析可以發(fā)展為一種對(duì)新生隱球菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定和流行病學(xué)調(diào)查的工具。

盡管序列測(cè)定非�；ㄙM(fèi)時(shí)間，但特殊的基因序列分析已被用來(lái)檢測(cè)新生隱球菌的多態(tài)性和區(qū)分不同菌株。現(xiàn)已明確新生隱球菌菌株之間存在DNA序列變化。例如，單拷貝的URA5基因在單個(gè)菌株和兩個(gè)變種之間就有廣泛的堿基對(duì)替換，最高可達(dá)基因編碼序列的6%。堿基對(duì)的替換通常發(fā)生在密碼子的第三個(gè)核苷酸或是在內(nèi)含子部份，因此蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生改變。重組的新生隱球菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ基因，其堿基順序在血清A 型株T 在型株之間存在著3.6%的差異。有實(shí)驗(yàn)證明，新生隱球菌具有基因替換重組能力。在新生隱球菌多基因家族的補(bǔ)充調(diào)查研究中，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)泛素基因，UBⅠ1和UBⅠ2，位于不同的染色體上。對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的重復(fù)片段的核苷酸序列有很大的差異（大約有15%）,包括編碼位點(diǎn)和內(nèi)含子數(shù)目也存在差異。重復(fù)序列發(fā)生如此高頻率的重組，其確切機(jī)制目前還沒(méi)有闡明。事實(shí)上，還不了解是否存在或存在多大程度的甲基化，才可能影響新生隱球菌的基因表達(dá)，和/或改變RFLP帶型。但是，從序列資料的研究中已明確新生隱球菌存在許多的基因轉(zhuǎn)化和/或重組事件，依此可建立基因序列水平上鑒定菌株的敏感方法。

作為最終分析結(jié)果，用幾種不同的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)新生隱球菌進(jìn)行鑒定是明智之舉。Brandt和美國(guó)隱球菌監(jiān)測(cè)組在鑒定33株隱球菌時(shí)，采用了多位點(diǎn)酶電泳、電泳核型、RADP技術(shù)和CNRE-1探針等多種方法，發(fā)現(xiàn)技術(shù)方法和分離菌株之間有一定的相關(guān)性，在一個(gè)方法中出現(xiàn)的差異可以用另外一種方法補(bǔ)償糾正。必須強(qiáng)調(diào)的是，選擇不同技術(shù)方法時(shí)要注意到，能夠真正地檢測(cè)到感染導(dǎo)致菌株微進(jìn)化的方法和缺乏鑒別菌株差異的方法之間的平衡�？傊�，多種分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以很好地鑒別新生隱球菌。

四、分子診斷

早期的檢測(cè)手段主要是DNA探針技術(shù)。習(xí)慣上總是盡量選擇基因組中拷貝數(shù)較高的序列做探針，這樣的探針具有較高的敏感性，所以都選擇重復(fù)序列片段作為DNA探針，如rDNA探針。自PCR技術(shù)誕生之后，用DNA探針直接進(jìn)行DNA-DNA雜交的做法便被淘汰。從理論上講，PCR技術(shù)可檢測(cè)到單個(gè)菌細(xì)胞�，F(xiàn)在通常的作法是將DNA探針用作PCR反應(yīng)中的靶DNA，經(jīng)過(guò)引物設(shè)計(jì)，直接建立PCR診斷方法。
Polacheck等以pBluescript SK質(zhì)粒為載體，以大腸桿菌DH5為宿主，構(gòu)建了血清D型新生隱球菌基因文庫(kù)，從中篩選獲得一段1.0kb的種特異性的中度重復(fù)順序及300bp的特異性的DNA片段。吳建華等以pUC18為載體，以大腸桿菌JM103為宿主，構(gòu)建了血清A型標(biāo)準(zhǔn)株DNA克隆庫(kù)，并從中篩選出了3個(gè)特異性片段：種特異性、變種特異性和A型特異性片段。其中種特異性探針為多拷貝序列，長(zhǎng)500bp左右，適合用于PCR反應(yīng)模板。顧菊林等建立套式PCR檢測(cè)隱球菌：應(yīng)用雙引物系統(tǒng)進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，第一步應(yīng)用外側(cè)引物可以診斷常見(jiàn)的病原真菌，能對(duì)代表8屬17種的25株醫(yī)學(xué)真菌進(jìn)行擴(kuò)增，而對(duì)所有細(xì)菌和人DNA均為擴(kuò)增陰性；第二步應(yīng)用內(nèi)側(cè)引物僅對(duì)新生隱球菌獲得擴(kuò)增，11株新生隱球菌均為擴(kuò)增產(chǎn)生預(yù)期長(zhǎng)度136bp的特異性片段，21株非新生隱球菌擴(kuò)增陰性。作者用上述方法對(duì)保藏的37份CSF標(biāo)本進(jìn)行了回顧性研究，結(jié)果表明，若以涂片法或/和真菌培養(yǎng)陽(yáng)性作為判別有無(wú)新生隱球菌存在的“0金標(biāo)準(zhǔn)”，PCR檢測(cè)法的敏感性為100%，而真菌培養(yǎng)的敏感性?xún)H為74%.PCR法檢測(cè)的特異性為93%，與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果有較好的符合率。

五、分子種系發(fā)生學(xué)

隨著基因組研究的不斷成熟，應(yīng)用DNA序列信息將更有力地說(shuō)明真菌之間的種系發(fā)生關(guān)系。高度保守的rRNA和rDNA是分子種系發(fā)生學(xué)研究的重點(diǎn)，新生隱球菌的這些基因序列已被進(jìn)行了研究。在新生隱球菌中，在8kb的重復(fù)DNA片段中，按順序排列著16s、5.8s、23s基因，而且按照同樣的方向轉(zhuǎn)錄。Fan測(cè)定了新生隱球菌的16s和23s rRNA基因序列，并且利用這些序列建立了新生隱球菌和其它真菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)狀圖。Gueho通過(guò)分析rRNA大亞基最可變區(qū)的部份序列，構(gòu)建了新生隱球菌與屬內(nèi)其他種隱球菌的親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)狀圖。在這個(gè)種系發(fā)生樹(shù)狀圖上，可以發(fā)現(xiàn)新生線狀黒粉菌血清A型和其他3個(gè)血清型相比有細(xì)微的進(jìn)化差異，有人推論它可能是按照不同的進(jìn)化速率發(fā)展的。

目前的研究主要集中在，研究其他基因及分析其祖先起源上。Cox等通過(guò)分析高度保守的肌動(dòng)蛋白基因，調(diào)查了新生隱球菌的種系發(fā)生學(xué)關(guān)系，用這個(gè)基因序列可以將新生隱球菌歸類(lèi)到真菌進(jìn)化的一個(gè)單獨(dú)分支，但是還需要測(cè)定更多的其他真菌的肌動(dòng)蛋白基因序列來(lái)進(jìn)行深入的亞群比較，并利用龐大的rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行對(duì)照修正。

隱球菌分子進(jìn)化研究的另一個(gè)有意義的用途是確定相關(guān)菌種間特異性遺傳毒力因子的差異。新生隱球菌是新生線狀黒粉菌的無(wú)性世代，是線狀黒粉菌科中唯一的有動(dòng)物致病性的菌種，也是擔(dān)子菌中主要的人類(lèi)致病菌。如現(xiàn)有的研究工作發(fā)現(xiàn)，用探針和其他異種擔(dān)子菌基因組雜交時(shí)，不能檢測(cè)到新生隱球菌莢膜基因（CAP59）和漆酶基因（CnLAC1）,在能夠產(chǎn)生莢膜的菌種中，如銀耳、羅倫特隱球菌，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與CAP59同源的基因。同樣用產(chǎn)黒素的CnLAC1基因作探針與其他幾種異種擔(dān)子菌雜交，也不能發(fā)現(xiàn)同源基因。這些結(jié)果提示，編碼莢膜和漆酶的原始基因要么在進(jìn)化的早期就已形成，要么是一群相關(guān)的真菌為適應(yīng)不同生態(tài)壓力產(chǎn)生的明顯分岐。為了進(jìn)一步了解其他異種擔(dān)子菌和致病性新生隱球菌的親緣關(guān)系，可以對(duì)毒性因子的進(jìn)化進(jìn)行深入研究。

Boekhout等用一系列分子生物學(xué)分型方法研究了新生隱球菌兩個(gè)變種的環(huán)境、動(dòng)物和臨床分離株，結(jié)果兩個(gè)變種在染色體數(shù)目和大小、RAPD等方面存在著顯著的差異，這些差異使得Boekhout懷疑兩個(gè)變種其實(shí)代表不同的種。目前許多爭(zhēng)論，認(rèn)為新生變種和格特變種具有獨(dú)立的特性，它們的基因型的確存在著明顯的差異，深入的分子生物學(xué)研究也證明這兩個(gè)變種之間存在著遺傳學(xué)上的交叉。