衣原體特異性抗原和抗體檢測方法-中國微生物菌種查詢網(wǎng)
1、材料 
①7—8d日齡的雞胚，McCoY細胞或HL細胞。 
②熒光顯微鏡，CO2孵箱。 
③沙眼衣原體免疫熒光診斷試劑盒，吉姆薩染色液。 
2、方法 
（1）標(biāo)本采集 
①沙眼病人眼結(jié)膜標(biāo)本的采集。在10%丁卡因局部麻醉下，用無菌狹長蓋玻片（0.5*2cm）刮取眼結(jié)膜上的濾泡組織，置于盛有1—2ml蔗糖磷酸鹽緩沖液的小玻璃瓶內(nèi)，-4—20℃冰箱 內(nèi)保存。 
②男性尿道炎標(biāo)本的采集。用無菌特制的尿道拭子伸入尿道口內(nèi)2—4cm，旋轉(zhuǎn)數(shù)次，抽出置于保存液中。 
③女性宮頸炎標(biāo)本的采集。用無菌窺陰器張開陰道口，以無菌特制的宮頸拭子深入宮頸2—3cm2，旋轉(zhuǎn)數(shù)次抽出放人保存液中。分離培養(yǎng)時，從低溫冰箱取出，加入鏈霉素200U、萬古霉索，在4℃冰箱中處理過夜備用；也可在保存液中預(yù)先加入慶大霉素、兩性霉素。 
（2）雞胚分離培養(yǎng)取7—8d日齡的雞胚，用8號針頭吸上述標(biāo)本接種卵黃囊0.25ml，35℃溫箱培養(yǎng)，逐日觀察，將2d后死亡及9d后仍存活者予以解剖。收集卵黃囊膜并制成涂片，吉姆薩染色后油鏡觀察，如在涂片中找到紫紅色顆粒者為陽性。如活體解剖者，可盲目傳1—2代。如仍找不到細顆粒EB（原體）者為陰性。 
（3）細胞分離培養(yǎng)：可選用McCoy、HEla-229、FL、HL等對衣原體敏感的長成單層的細胞，載體可用玻璃小瓶或塑料培養(yǎng)板，在底部可預(yù)置適當(dāng)大小的蓋玻片。接種標(biāo)本后，1800—3000g離心1h，促進EB進入細胞。吸附1h，吸去上清液，加入含放線菌酮0.5ug的1640維持液， 35℃CO2孵箱或密封培養(yǎng)，48—72h后取出蓋玻片，漂洗、甲醇固定后，可作吉姆薩、碘液或單克隆抗體熒光抗體染色，高倍顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察包含體。必要時，亦可作盲目傳1—3代。 
    細胞培養(yǎng)法的敏感性為80%—90%，特異性為100%，是目前診斷沙眼衣原體感染最可靠的方法，因此是評價其他實驗室診斷方法的金標(biāo)準(zhǔn)。 
① 涂片檢測：包括結(jié)膜涂片和宮頸拭子涂片，前者可用吉姆薩染色或單克隆抗體熒光抗體染色，尋找包含體；后者可用單克隆抗體熒光抗體染色尋找涂片中的RB（始體）或EB顆粒。此法敏感性較低，與細胞培養(yǎng)法比較，敏感性僅為70%—80%，特異性為80%。但此法在于簡便易行。約需20min，但需有高質(zhì)量的單克隆抗體和熒光顯微鏡，且觀察人員必須有豐富的經(jīng)驗。 
② ELISA檢測衣原體抗原此法應(yīng)用的主要是結(jié)膜刮片、尿道和宮頸拭子，時間需2—3h。一般報告其敏感性為62%—98%，特異性為92%—98%。有經(jīng)驗的實驗室人員，診斷泌尿生殖道衣原體感染時，其敏感性為細胞培養(yǎng)的70%—80%。但經(jīng)不斷改進后的多家公司生產(chǎn)的診斷試劑，其敏感性已提高到85%—90%。 
③ 快速診斷試劑：最近出現(xiàn)了一些快速診斷試劑，例如美國加利福尼亞州新傳生物技術(shù)公司生產(chǎn)的CHLAMYGEN衣原體快速診斷試劑盒是一種酶反應(yīng)檢測系統(tǒng)，含有一合成底物，預(yù)置于特制的拭子上。用此拭子采集尿道或官頸的上皮細胞，滴加所附試劑A和B各2滴于拭子上，等待10min，再滴加2滴試劑C，1min內(nèi)出現(xiàn)紫色者為陽性。全過程只需12min，確實快速 。與細胞培養(yǎng)法相比，其敏感性為97.2%，特異性為99.2%。但一些專家認為，目前的一些快速診斷試劑，還都存在著敏感性和特異性方面的問題。 
（4）檢測特異性抗體———微量免疫熒光檢測法：Wang等創(chuàng)建的微量免疫熒光（MIF）技術(shù)，是檢測衣原體抗體較好的方法。此項技術(shù)可作分離物的血清學(xué)分型，也可嚴格應(yīng)用于血清流行病學(xué)的研究。它可給人們提供多方面有用的資料：臨床致病譜和感染的后果，在不同人群中流行病學(xué)的分布。這是一種主觀性較強的試驗，因此觀察者需要有豐富的實踐經(jīng)驗。一般認為此法不適用于診斷衣原體的早期感染，且敏感性和特異性均不高。然此法作為流行病學(xué)調(diào)查，頗為簡便。 
    用此法測定的型抗原是位于衣原體表面的表面抗原�？捎脧妷A處理（pH12.5，37℃，1h），溶解于氯仿一 甲醇一水中，分層提取脂類 。該型抗原不會被1%胰酶、鏈霉蛋白酶或過碘酸鹽所破壞，是與蛋白質(zhì)結(jié)合的類脂半抗原。微量免疫熒光技術(shù)把沙眼衣原體共分為15個血清型：即A、B、Bb 、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L1、L2、L3，前12型稱為沙眼包含體結(jié)膜炎衣原體，后3型為淋巴肉芽腫衣原體。