將200 µL培養(yǎng)至對數(shù)期的白色念珠菌的菌懸液(106 CFU/mL)分別加入96孔板中，再加入20µL不同濃度的紫草素藥液，使其終濃度分別為64、32、16、8、4μg/mL，37℃培養(yǎng)24h后于595 nm處測定吸光值。以不加藥物組為空白對照。實驗重復(fù)3次，取平均值。其中，紫草素對白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)值為菌體的OD值下降80%以上的最低藥物濃度。從大于MIC的各孔中分別取10µL菌懸液涂布于SDA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后觀察菌體生長情況，最低殺菌濃度(MFC)為平板上沒有菌體生長的最低藥物濃度。

 紫草素對白色念珠菌細(xì)胞膜滲透性的影響

     將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液按2%接種量接種于20mL RPM-1640液體培養(yǎng)基中，以150r/min、30℃恒溫培養(yǎng)16h后，離心棄上清液，用PBS洗滌菌體2次，制成適當(dāng)濃度的白色念珠菌菌懸液，分別向其中加入濃度為MIC和2MIC的紫草素繼續(xù)培養(yǎng)12h，每隔2h分別取樣液4mL，4000r/min離心10min棄沉淀，用紫外分光光度計于260nm下測定上清液中DNA和RNA等大分子物質(zhì)的變化。以不加藥為空白對照組，實驗重復(fù)3次，取平均值。

 紫草素對白色念珠菌形態(tài)的影響

     將培養(yǎng)至對數(shù)期的白色念珠菌菌懸液(107 CFU/mL)接種于含紫草素終濃度為MIC的YEPD液體培養(yǎng)基中，150r/min、30℃振蕩培養(yǎng)。于6h和16h分別取1mL菌懸液，3000r/min離心5min后棄上清。再加入0.5mL PBS緩沖液和0.5mL 2.5%的戊二醛，4℃冰箱固定過夜。次日用PBS緩沖液沖洗2次，50%、80%、100%乙醇依次脫水1次，每次15min，100%乙醇浸沒的電鏡樣品置4℃冰箱中降溫10min后，放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的樣品溫度升至室溫后取出，噴金鍍膜，使用掃描電鏡觀察照相，以不加藥組為空白對照，實驗重復(fù)3次。

 紫草素對白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

     將2mL RPM-1640培養(yǎng)基及300μL培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液(106CFU/mL)分別加入6孔板中，每孔內(nèi)分別放一片無菌蓋玻片，37℃培養(yǎng)4h后，以加入300μL濃度為MIC的紫草素的孔為實驗組，加入300μL去離子水的孔為空白對照組，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)16h。然后吸出每孔中的液體，用PBS緩沖液洗滌2次。陰干后于避光環(huán)境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的鈣離子熒光探針(Fluo-3AM)，于37℃培養(yǎng)箱中孵育45min進行探針裝載。吸出剩余的熒光探針染液并用PBS緩沖液沖洗，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育15min，以確保Fluo-3AM完全轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-3。取出蓋玻片，用10μL抗熒光淬滅劑進行封片后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度，并按照公式(1)計算鈣離子濃度([Ca2+])變化百分率。實驗重復(fù)3次。

     制備10μL含紫草素終濃度為1/2MIC和MIC的菌懸液(106 CFU/mL)并用移液槍接種于卵黃培養(yǎng)基上，以加等量PBS的菌懸液為空白對照，于37℃下培養(yǎng)48h。待培養(yǎng)結(jié)束后，用刻度尺分別測量平板上的菌落直徑和沉淀圈直徑，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示，PZ值按下列公式計算。PZ值=菌落直徑/總直徑�？傊睆�=菌落直徑+菌落周圍沉淀圈的直徑。PZ=1，表示無磷脂酶活性；PZ值<1，表示有磷脂酶活性，且PZ值越大，磷脂酶的活性越弱。

 紫草素對白色念珠菌PLB1和PLB2相對表達量的影響

      白色念珠菌PLB1和PLB2基因的檢測: 提取模板DNA，根據(jù)GenBank中已發(fā)布的白色念珠菌的基因序列，利用Primer 5.0軟件及參考文獻設(shè)計磷脂酶相關(guān)基因PLB1和PLB2的上下游引物，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。PCR擴增條件為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃ 10min。

      紫草素對白色念珠菌PLB1和PLB2相對表達量的影響: 將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液接種到含紫草素終濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)16h后，采用Trizol法提取RNA，用微量核酸測量儀進行RNA濃度的定量。采用2步法反轉(zhuǎn)合成模板cDNA，根據(jù)設(shè)計合成RT-PCR引物進行擴增。以18SrRNA為內(nèi)參基因，以不加藥物組為空白對照。待反應(yīng)結(jié)束后分析RT-PCR的擴增曲線和融解曲線，并計算PLB1和PLB2基因的相對表達量。

 統(tǒng)計學(xué)方法

     采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。予以卡方檢驗和t檢驗。以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。