Maximum透射2D圖像分析：

應(yīng)用MetaXpress®高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件進(jìn)行圖像分析。全自動(dòng)的對(duì)圖像進(jìn)行定量分析使用的兩種方法：做透射后進(jìn)行2D分析和Z-stack的3D水平分析。對(duì)2D透射圖像分析， Z - s t a c k 序列圖像進(jìn)行Maximum透射，然后用軟件預(yù)置的神經(jīng)突觸分析模塊進(jìn)行分析。輸出的評(píng)價(jià)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞表型及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度的參數(shù)包括：突觸總長(zhǎng)度、突觸個(gè)數(shù)、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力。透射光的圖像用Best Focus算法進(jìn)行2D透射后進(jìn)行分析。2D圖像的分析速度快，可精確的評(píng)價(jià)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的程度。但是，2D分析有一定的局限性，這種方法無(wú)法計(jì)算如體積這樣的參數(shù)，并且得到的只是單層的結(jié)果。圖2和3所示為熒光合成圖，對(duì)照組和魚(yú)藤酮處理組圖片被神經(jīng)突觸模塊分析后的mask圖片。分析參數(shù)包括：突觸總長(zhǎng)度、突觸個(gè)數(shù)和細(xì)胞總個(gè)數(shù)(細(xì)胞體)。圖4顯示了神經(jīng)突觸長(zhǎng)度、突觸個(gè)數(shù)和細(xì)胞活力的隨化合物的處理而減少，神經(jīng)毒性化合物包括：磷酸三苯酯、四乙基秋蘭姆、六氯酚、魚(yú)藤酮和甲基汞(均為10μM)。

3D可視化和3D圖像分析：

MetaXpress軟件可以將Z軸序列圖像重構(gòu)成3維立體結(jié)構(gòu)觀(guān)察細(xì)胞核及細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行3D水平的分析。圖像應(yīng)用用戶(hù)自定義的3D分析中“findfibers”功能，“fibers”數(shù)值評(píng)價(jià)神經(jīng)突觸；同時(shí)計(jì)算了細(xì)胞個(gè)數(shù)。計(jì)算對(duì)象首先在每層中識(shí)別出，然后使用“connect bybest match”功能將其在3D空間中連接起來(lái)。3D分析使突觸計(jì)算更準(zhǔn)確，是一個(gè)評(píng)估神經(jīng)連接等更好的方法。3D分析得到的參數(shù)包括突觸個(gè)數(shù)、細(xì)胞體積、總突觸體積、分支個(gè)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。細(xì)胞總個(gè)數(shù)是通過(guò)在Hoechst染色通道識(shí)別“sphericalb j e c t s ” 。圖5 所示為分析識(shí)別“fibers”和“nuclei”的蒙板。另一個(gè)用戶(hù)自定義模塊分析細(xì)胞活力特征(鈣黃綠素陽(yáng)性的胞體)和線(xiàn)粒體完整性(MitoTracker Orange陽(yáng)性的胞體)。細(xì)胞分類(lèi)分析可以得到活細(xì)胞個(gè)數(shù)(鈣黃綠素陽(yáng)性的胞體)和有完整線(xiàn)粒體的細(xì)胞個(gè)數(shù)(MitoTracker Orange陽(yáng)性)。計(jì)算結(jié)果包括細(xì)胞個(gè)數(shù)(total nuclei)，活細(xì)胞個(gè)數(shù)(Calcein AM positive)，以及細(xì)胞體積和熒光強(qiáng)度。圖5B和5C所示為“Calcein AMpositive cytoplasm”，“MitoTracker positive cytoplasm” 和 “nuclei”的識(shí)別蒙板。圖6顯示了化合物影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的幾個(gè)特征參數(shù)： 突觸個(gè)數(shù)的減少(fibers)，節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)，以及活細(xì)胞個(gè)數(shù)和完
整線(xiàn)粒體的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

應(yīng)用OrganoPlates做神經(jīng)毒性的3D分析：

表型分析包括在程度和復(fù)雜性上定量3D分析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得到多個(gè)參數(shù)。在這個(gè)神經(jīng)模型系統(tǒng)里，我們?cè)u(píng)估了模型的重復(fù)性、多參數(shù)，并檢測(cè)了多個(gè)已知的神經(jīng)毒性化合物。通過(guò)這些分析方法，我們準(zhǔn)確得到了化合物對(duì)復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的濃度依賴(lài)的抑制作用曲線(xiàn)。因此驗(yàn)證了此模型可以用于高通量的多參數(shù)的預(yù)測(cè)化合物的神經(jīng)毒性。

結(jié)論：

我們建立了一個(gè)可定量的共聚焦高內(nèi)涵成像方法， 結(jié)合使用M I M E T A SOrganoPlates，對(duì)化合物影響神經(jīng)細(xì)胞活力和形狀進(jìn)行高通量的3D表型分析。共聚焦成像和多參數(shù)3D分析模塊提供了一個(gè)在3D水平上計(jì)算和統(tǒng)計(jì)神經(jīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)和突觸特征的方法。3D分析結(jié)果可計(jì)算出化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞影響的EC50值，幫助篩選出毒性化合物。

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