簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)印跡在1979年首先被提出。自那以后，隨著技術(shù)，試劑和成像技術(shù)的改進(jìn)大大拓寬了蛋白質(zhì)印跡的使用，使其成為當(dāng)今生命科學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一。

然而，Western印跡的一般工作流程變化不大。 首先進(jìn)行蛋白的抽提，然后通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印并用一抗和二抗進(jìn)行雜交，最后顯色。 通過(guò)這些步驟，蛋白質(zhì)印跡需要對(duì)設(shè)備，培訓(xùn)，試劑投入大量的花費(fèi)和時(shí)間的花費(fèi)。

標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡流程需要兩天的時(shí)間才能從樣本獲得圖像。 因此，在分析大量樣品或進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，很容易看出Western Blotting會(huì)有一定的瓶頸。

IN-cell western - 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的重新思考，將蛋白質(zhì)印跡中的蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量與ELISA的重復(fù)性，快速性和高通量相融合。 細(xì)胞長(zhǎng)在無(wú)菌的培養(yǎng)孔中，在原位固定和透化。 隨后用特定的一抗進(jìn)行孵育，然后用特異性熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。 使用近紅外（NIR）光譜中的染料通常用于減少組織培養(yǎng)塑料板相關(guān)的自發(fā)熒光和噪音。

圖1：典型的in-cell western成像

Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)專門設(shè)計(jì)用于在兩個(gè)NIR通道（658 nm和785 nm）以及可見(jiàn)熒光波長(zhǎng)（488 nm和520 nm）內(nèi)進(jìn)行成像，從而實(shí)現(xiàn)在孔內(nèi)的多重成像。 這種多重檢測(cè)允許在單個(gè)孔中評(píng)估多個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)。

通過(guò)使用光電倍增管（PMT）和雪崩光電二極管（APD）檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，Sapphire可實(shí)現(xiàn)信號(hào)選擇性，靈敏度和成像速度使其成為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡的理想選擇。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa細(xì)胞進(jìn)行系列稀釋并以每孔0.2mL的體積接種到無(wú)菌96孔組織培養(yǎng)板中，并生長(zhǎng)至約80％。所有孔都使用100％甲醇室溫滲透15分鐘。

In-cell western

固定和透化之后，將細(xì)胞在PBS中沖洗，在室溫下用含1％魚(yú)膠的PBS封閉1小時(shí)，然后在4℃下孵育α-tublin和beta-actin 過(guò)夜。在用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800的二抗孵育60分鐘，將樣品用PBS洗滌三次。

將二抗與RedDot ^TM 1核染色一起孵育用來(lái)歸一化總細(xì)胞數(shù)目。 成像前如前所述洗滌樣品板。

成像

洗滌后，使用Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

結(jié)果和討論

在本說(shuō)明中，我們展示了使用Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜系統(tǒng)在定量細(xì)胞內(nèi)蛋白的能力。 HeLa細(xì)胞使用α-tublin和beta-actin抗體，接著分別用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800二抗進(jìn)行孵育。 將所有孔用RedDot ^TM 1核染色劑染色歸一化總細(xì)胞數(shù)目標(biāo)。 使用Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)獲取圖像，如圖2中所示。所顯示的圖像顯示了可實(shí)現(xiàn)較高的靈敏度和特異性。

將連續(xù)稀釋的HeLa細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)，固定并透化。 A）使用AzureSpectra 550（綠色）探測(cè)第1-3列的beta-Actin 。 B）使用AzureSpectra 800（藍(lán)色）探測(cè)第3-6列的Tubulin 。 C）整個(gè)板用RedDot1核染色作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照（紅色）染色。 D）同時(shí)掃描各個(gè)通道，然后使用Sapphire Capture軟件將其圖像進(jìn)行整合。

在96孔板上進(jìn)行細(xì)胞Western blotting可以準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白的原位表達(dá); 并提供高通量的方法來(lái)評(píng)估多重檢測(cè)，終點(diǎn)檢測(cè)，感興趣的蛋白質(zhì)和重復(fù)性。 通過(guò)使用NIR抗體和Azure Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)，在多重分析的潛力和通量上都大大提高。