通常來講，real-time PCR（ qPCR）的反應程序不需要像常規(guī)的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產(chǎn)物長度在 80～150 bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。 
 
SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷 PCR 產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。 
 
1、無 Ct 值出現(xiàn) 
 
檢測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時采集，Taqman 法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。 
引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性。 
模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 
模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況。 
 
2、Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct>38） 
 
擴增效率低：反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 
PCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。 
PCR 產(chǎn)物太長： 一般采用 80～150 bp 的產(chǎn)物長度。 
 
3、標準曲線線性關系不佳 
 
加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。 
標準品出現(xiàn)降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。 
引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。 
模板中存在抑制物，或模板濃度過高。 
 
4、負對照有信號 
 
引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。 
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 
模板有基因組的污染：RNA 提取過程中避免基因組 DNA 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。 
 
5、擴增效率低 
 
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 
反應條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。 
反應體系中有 PCR 反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。 
 
6、擴增曲線異常，比如 S 型曲線 
 
參比染料設定不正確：MasterMix 不加參比染料時，選 NONE。 
模板的濃度太高或者降解。 
熒光染料的降解。 
 
7、定量 PCR 儀的開關機順序是怎樣的？ 
 
按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。 
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量 PCR 儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量 PCR 的收集軟件，進行實驗。 
　　 
關機順序：確認實驗已經(jīng)結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR 儀主機的電源，最后關閉電腦。 
 
9、什么是 CT 值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？ 
 
CT 值與起始 DNA 濃度的對數(shù)成反比： 
如果：不同管之間的 PCR 反應效率相同。這些 PCR 的反應效率接近 100%�？梢詮纳厦娴墓�式推出相對含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理后 0、24、48 小時 IL-2 基因在某種組織中的表達量的變化，所用內(nèi)對照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的測定結果都是 CT 值，而沒有通過標準曲線測定總 RNA 的 pg 數(shù)。　 
　 
10、定量 PCR 基因表達的實驗數(shù)據(jù)應該如何處理？ 
 
總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。 
參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX，這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映 PCR 進程。ROX 校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。 
內(nèi)對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數(shù)目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同時定量一個內(nèi)對照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。內(nèi)對照校正使不同樣品的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。 
計算相對于基準樣品（Calibrator）的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0 小時和 6 小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6 小時/0 小時、患病/正常。 
 
11、怎樣判斷定量 pcr 儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？ 
 
一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。 
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行 ROI 的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。 
清除樣本加熱塊污染的步驟如下： 
用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。 
吹打數(shù)次。 
將廢液吸入廢液杯中。 
重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。 
確認反應孔中的殘留液體蒸發(fā)完。 
 
12、內(nèi)標法和外標法哪種數(shù)據(jù)更精密？ 
 
是同樣可靠的。 
內(nèi)標的優(yōu)點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發(fā)生競爭與抑制，導致它們的 PCR 效率有差異。 
外標的優(yōu)點在于目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發(fā)生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的 PCR 效率有差異。 
兩相比較，內(nèi)標法與外標法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。 

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